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1、2 0 0 2 年1 2 湖南省昆虫学会光辉五十年1 5 3 和妒 - “静N 啐w 舻x r 淞隅郴弓N 粥滴不瞄弼 而叫嘏一隅嘲岱舻* E N 弓讧看缸嚣蝴 i ：10 ，1 ， 。1 “。“1 1 。1 1 。1 、| ”。1 1 叫。1 j 1 尊。_ 二， 蠡搽“昆虫杆状病毒表达系统的应用进展i 耄囊 ： j I k 。j 1 ，1 ， _ “_ 叫_ I 1 _ _ _l _ JIlIl，1l 1 J ，h r ；h ：。l 鹅毒毒薯尊乏毒乏誊翔篙菇，。巍莫j 童晓每 妻 ；i ：i 毫崇毒杀譬鬻 备“v “。“汕“。“： 扣“j “j j “- ， m 。o * ：1 ho ；r
2、 知+ k i “7 o * 二“v 雾- _ 0 他：叶o 皆南琳学院昆虫蒋潺研宠所。溯南株溯7 生1 2 9 a ) 、j 心眷三 ：= _ 雪i 譬孑露 j I h o ， ： ： 二 I h “。，p I l ， h ， p ，1 lJ ，I “ J ： ：h ： J I r ； 她竹诖= 仁，删 ，啦= 憎q = 叫目叫：8 b o 抒q i 聿哿 地 世碍协扣；，恤一埘q 把N 蟓抑 = 咀，水删+ w 缸 擒要昆虫轩状病毒表遮系统( B E V 5 ) 是当今基固工程四大表达系统之一，关于它的应用日新月异本文从 杆状病毒厦其袭选系统的基本特点，扦状病毒的垂直传播轩杖病毒表达系统表
3、达扑源基因的最新进展，杆状 病毒杀虫荆等方面进行了全面练述 关键调昆虫杆状病毒件F 状病毒表达暮统I 杆状病毒杀虫荆 S t u d i e sP r o g r e s so nA p p l i c a t i o no f I n s e c tB a c u l o v i r u sE x p r e s s i o nS y s t e m L i uG a o - - q i a n g ，W e iM e i - - e a i ，W a n gX i a o - - l i n g ( I n t t t u t eo fl l l 辩t tR e o u 抖- C e n
4、t r I lS o u t hF o r e , t r yU n l v e r s t t y g h u z h o u 4 1 2 0 0 6 H u n a n ) A b s t r a c t jI n s c c th e e u l o V t g t e x p a e s s t o ns y s t e mh a Jb e e no 睫o ft h ef o u rm a i ne x p r e 螂ns y s t e mi nl i e n s e n g i n e e r i n g t h e r e a r ea m p l e _ n dv a r i
5、e da p p h c a t t o n 姐i t I nt h i sp a p e r t h ee l e m e n t a r yc h a r a c t e r i s t i co f h e c u o v u u a 日db a c u l o v i r u e x p r e s s i o ns y s t e m t h ev e r t i c a l 仃I n s m h 。啪o fb e c u l o v i r u t h ed e v e l o p i n g p p l H t 肌0 1B a c u l o v m e x p r e s s
6、i o ns y s t e ma n dt h ep f o g 晴o nh e c u l o v l r u s m 州K 如a 比r e v i e w e d K e yw o r 出：i m e c tb a c u l o v i r e s l h c u l o v k we x p r e s s i o ns y s t e m ；h e c e l o v t r a - m 睇t k 鼬 随着昆虫细胞培养技术和昆虫病毒分子 生物学的迅速发展，近年来建立了杆状病毒 表达系统( b a c u l o v i r u se x p r e s s i o n v e c
7、t o r s y s t e m ，B E V S ) ，由于这个系统具有完备的 翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的 能力等，现已成为当前基因工程四大表达系 统之- - ”。近年来有关它的应用日新月异，本 文拟对其应用的最新进展作一全面的综述 1 杆状病毒概述 1 1 杆状病毒的基本特性 杆状病毒包括核型多角体病毒( N P V ) 属和颗粒体病毒( G V ) 属。昆虫是它们的自然 寄主，且杆状病毒具有宿主专一性o 】 杆状病毒粒子是由杆状核衣壳( r o d s h a p e dn u c l e o c a p s , d ) 和包被它的二层脂质 蛋白囊膜( e n v e l
8、o p e ) 所组成。核衣壳包括衣 壳( c a p s i d ) 蛋白和髓核( c o r e ) 。其中衣壳蛋白 是杆状病毒粒子的主要结构蛋白 髓核由病 毒D N A 分子和与其密切相关的碱性蛋白构 成。碱性蛋白同D N A 紧密结合以维持其复 杂有序的超螺旋结构，并且能够增强杆状病 毒D N A 的感染性o 。 杆状病毒感染宿主细胞后能够产生两种 类型的病毒：一种是包涵型病毒( o c c l u d e d v i r u s ，O V ) ，又称多角体获得型病毒 ( p o l y h e d r o n d e r i v e dv i r u s ，P D V ) 另一个 是
9、芽生型病毒( b u d d e dv i r u s ，B V ) ，又称胞外 病毒( e x t r a c e l l u l a rv i r u s ，E C V ) “】 根据囊膜中核衣壳数量的不同，多角体 病毒粒子可被分为单粒包埋型和多粒包埋 型。单粒包埋型核型多角体病毒( s i n g l e n u c l e o c a p s i dn u c l e a rp o l y h e d r o s i sv i r u s ， S N P V ) ，其囊膜内只含有一个核衣壳，而多 1 5 4 湖南省昆虫学会成立5 0 周年庆典暨2 0 0 2 年学术年会论文集 2 0
10、0 2 年1 2 月 粒包埋蛰核型多角体病毒 ( m u h i n u c l e o e a p s i dn u c l e a rp o l y h e d r o s i s v i r u s ，M N P V ) ，其囊膜内含有多个核衣 壳” 在结构和功能的研究方面，目前人们只 是勾画了杆状病毒的结构框架，其详细的结 构和相对应的功能尚不明了 1 2 昆虫杆状病毒表达系统的特点 昆虫杆状病毒载体系统作为当前基因工 程四大表达系统之一，具有下列优点s 1 、对 人、畜和植物安全 2 ，对外源基因容纳量大 3 、高效表达外源基因 4 、多角体是一个特异 性标记，便于重组病毒的挑选；5
11、 ，大幅降低饲 料寄主昆虫的成本，并能获得大量有重要价 值的外源基因表达产物；6 与细菌表达系统 相比具有突出的优势昆虫杆状病毒表达系 统具有完备的翻译后加工修饰系统( 如磷酸 化、糖基化蛋白酶特异性水解和酰胺化等) ， 且合成的蛋白质稳定，具有与天然蛋白相同 的生理活性C 4 - S 1 3 杆状病毒在昆虫中的垂直传播 杆状病毒的传播分为直接传播和间接传 播。前者无需媒介介导的感染 后者指媒介介 导的传播。直接传播又可分为水平传播和垂 直传播“】。 发现杆状病毒在昆虫中的垂直传播现象 首先是由国外学者发现的。如莎草粘虫 S p o d o p t e r ae x e m p t a 草地夜
12、蛾S f r u g i p e r d a 海灰翅夜蛾S L i t t o r a l i s 等中的垂直传播现 象。有关这方面的研究主要在国外取得一些 成果，我国从事这方面的研究单位很少。 证明杆状病毒在昆虫中的垂直传播实验 是M o r i 等利用杆状病毒介导荧光素酶基因 在家蚕中的表达实验。我国刘祖强等利用绿 色荧光蛋白基因为标记基因构建重组杆状病 毒并感染昆虫，从基因水平上证明宿主昆虫 在低剂量重组病毒感染之后不仅能稳定携 带，而且能通过生殖系统垂直传播到子代昆 虫，实现了绿色荧光蛋白在昆虫体内的传代 表达J 2 昆虫杆状病毒载体系统表达 外源基因的研究进展 自从1 9 8 3 年
13、S m i t h 和S u m m e r s 首次利 用苜蓿Y 纹夜蛾核型多角体病毒 ( A c M N P V ) 表达人8 一干扰素以来，至今已 有数百种外源基因在杆状病毒载体系统中得 到表达”】。 我国是8 0 年代末才开始做利用昆虫细 胞或虫体作为生物反应器来生产外源基因产 物的研究的目前在生物反应器真正应用的 细胞系是从国外引进的秋粘虫S p o d o p t e r a f r u g i p e r d a 卵巢组织的细胞系s f - - 9 。现已用 s f 一9 和家蚕细胞系表达成功了许多种外源 基因，如鸡马立克氏病毒糖蛋白B 抗原基 因、乙肝病毒表面抗原基因，人一干扰
14、素基 因，人白血细胞介素4 、1 2 、E B 病毒膜蛋白基 因、荧光素酶基因、P P 3 8 基因，尿激酶原基 因、小鼠金属硫蛋白基因等o ” 外源基因在昆虫细胞中表达水平差异较 大，有的只有l m g L ，但高的可达6 0 0 m g L 用N P V 载体生产处源基因较有效的途径是 用带有外源基因的重组病毒直接感染昆虫幼 虫，在各表达系统中，家蚕( B o m b y xm o r i ) 核 型多角体病毒( B m N P V ) 一家蚕表达系统是 较理想的系统。利用家蚕作为生物反应器，季 平等已成功表达了慈姑蛋白酶抑制剂B 基 因、乙肝病毒表面抗原基因、禽马立克氏病毒 糖蛋白B 抗
15、原基因和促黄体素释放激索与 乙肝表面抗原嵌合的基因等“。 魏婉丽等研究了家蚕系统中高效表达的 重组人丁酰胆碱酯酶( r h B C h E ) 的生化性质， 并与天然人丁酰胆碱酯酶( n h B C h E ) 作了比 较。结果表明，人丁酰胆碱酯酶与天然丁酰胆 碱酯酶具有相似的底物亲和力、抑制剂敏感 性及其可重复活化性和对抗体的反应性等。 但人丁酰胆碱酯酶的糖基化程度较低 1 ”。 杨林等进行了G S T 融合蛋白在杆状病 毒系统中表达的可溶性研究。G S T 融合蛋白 是由常用的转移载体G s T 融合载体表 2 0 0 2 年1 2 湖南省昆虫学会光辉五十年 1 5 5 达的蛋白。但在应用原核系统表达G S T 融合 蛋白时，往往会得到不可溶的表达产物，这给 表达产物的纯化，活性保证等带来了困难。在 杨林等的研究中，他们向感染了病毒的细胞 裂解物的裂解液中加入固体十二烷基肌氨酸 钠至终浓度为1 5 ，并将T r i t o n X 一1 0 0 的 比例由1 提高到2 。结果显示至少有1 3 的G S T 一6 x H i s E t p 2 8 处于溶解状态，可溶 性G S T 经亲合层析，目标蛋白得到了纯 化1 ” 一赵炳文等以胎盘组织提取的m R N A 为 受体模板，R T
