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1、氯霉素单酯水解抗体酶在酵母细胞表层的展示 林影2 田中渥夫2 植田充美3 藤井郁雄3 同谷健 1 中国广州华南理工大学生物工程系5 1 0 6 4 1 电话：0 2 0 - 8 7 11 2 7 4 8 传真：0 2 0 - 8 7 5 4 7 0 8 9 E - m a i l ：f e y l i n s c u t e d u , c n 2 日本京都6 0 6 - 8 5 0 1 京都大学工学研究科合成与生物化学喜攻 日本大阪5 6 5 0 8 7 4 生物分子工学研究所 抗体酶象天然酶一样可以加速化学反应的过程，到目前为止，已有1 0 0 多种 化学反应可以由抗体酶催化进行，尤其广泛
2、地应用于化学转化反应中。抗体酶的 标准制备方法是：合成反应的稳定过渡态化合物作为半抗原，在动物体内免疫生 成抗体中筛选抗体酶。尽管一些报道的抗体酶具有与天然酶相似的效率，但大部 分由标准方法获得的抗体酶很难得到高的催化效率。因此，人们试图通过体外蛋 白进化的技术寻求解决抗体酶活力低的问题，噬菌体表面展示技术已被用于改进 抗体酶活性1 。酵母细胞表层展示技术，由于具有适合表达哺乳动物蛋白基因和利 用流速细胞仪进行高通量细胞筛选分离等优点，近年来已经被利用于抗体库的筛 选2 。本文利用酵母细胞表层展示体系3 功能表达抗体酶6 D 9 ，为进一步抗体酶库 构建和抗体酶进化筛选提供有利的工具。 抗体酶
3、6 D 9 由氯霉素单酯水解反应过渡态类似物在小鼠体内免疫生成的抗体 中筛选得到，并具有水解氯霉素单酯产生活性的氯霉素的能力( 图1 ) ，编码6 D 9F a b 片段的基因已经在大肠杆菌中克隆表达。 印 r 丫、“ “N 以、 “”C O C H C l 2 图16 D 9 抗体酶催化水解氯霉素单酯水解生成活性氯霉素。1 氯霉素单酯，2 活性氯霉素 3 反应过渡态类似物，4 氯霉素单酯衍生物用于抗体酶活性分析。 我们通过编码6 D 9 轻链基因与a 一凝聚素基因融合，表达在S c c h a r o m y c e s 。i s i 。e 酵母细胞表面，6 D 9 重链的F d 片段同一酵
4、母细胞内分泌表达，由于抗体 1 0 6 轻链与重链F d 片段分子间存在二硫键的作用，抗体酶6 D 9F a b 片段被展示在酵母 细胞表层。酵母细胞表层6 D 9 抗体酶与反应过渡态类似物的F I T C 结合物反应，并 通过流速细胞仪可检测到抗体酶对反应过渡态类似物的亲和活性( 图2 ) ：如图3 所示，酵母细胞表层抗体酶6 D 9 不但在水解氯霉素单酯生成活性的氯霉素的反应 中呈现高的催化活性，同时催化反应还受到反应过渡态类似物的抑制作用( 图略1 。 研究结果表明抗体酶6 D 9 被功能地表达在酵母细胞表层。 此外，若编码6 D 9F d 的基因片段与仪一凝聚素基因融合，而轻链基因构造
5、在分 泌载体上，将两个基因片段在酵母细胞上共表达，形成另一种构像6 D 9F a b 2 ，研 究表明：在部分的酵母细胞表层，6 D 9F a b 2 不能形成正确的构像，而呈现低的反 应过渡态类似物的亲和活力( 图2 ) 和水解催化活力( 图3 ) 。 图3 流速细胞仪柱状图。酵母细胞分别展现了6 1 3 9F a b 的两种形式及对照细胞，与标记了F I T C 的过渡态类似 物( T S A ) 反应后，用F A C S C a l i b u r 流速细胞仪测定 1 0 5 个细胞的的柱状图和平均荧光值( M F U ) 。C o n t r o l 为对照细胞：与分别展示了F a b
6、 和F a b 2 的样品细胞。 图4 酵母细胞表层6 1 3 9 抗体酶 催化水解氯霉素单酯生成氯霉 素。1 为6 1 3 9F a b 展示酵母的催 化产率，2 为6 D 9 F a b 2 展示酵母 的催化产率。 参考文献： 1 F u j i i ，I ，S F u k u y a m a , Y 1 w a b u c h i ，a n d R T a n i m u r a 1 9 9 8 N a t B i o t e c h n 0 1 1 6 ：4 6 3 4 6 7 、 2 B o d e r , E T S K M i d e l f o r t , a n dK D W i t t r u p 2 0 0 0 P r o c N a i l A c a d S c i U S A 9 7 ：1 0 7 0 1 1 0 7 0 5 3 U e d a ，M 。a n d A T a n a k a 2 0 0 0 B i o t e c l m 0 1 A d v 1 8 ：1 2 1 - 1 4 0 1 0 7
