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1、实实 验验 九九 噬菌体效价的测定噬菌体效价的测定 目的要求目的要求 1 1、掌握噬菌体效价测定的原理及方法、掌握噬菌体效价测定的原理及方法 2 2、观察噬菌斑的形态、观察噬菌斑的形态 实实 验验 内内 容容 一一 培养基和实验物品的准备培养基和实验物品的准备 本次实验准备工作（2人/组） 1 1、配制牛肉膏蛋白胨液体培养液、配制牛肉膏蛋白胨液体培养液（ pH 7.4-7.6pH 7.4-7.6 ）； （已准备好）（已准备好）。 2 2、测定效价时稀释用、测定效价时稀释用9ml9ml牛肉膏蛋白胨液体培养液牛肉膏蛋白胨液体培养液 3 3支支/ /组，分装于组，分装于18180mm18180mm试
2、管；试管； 3 3、牛肉膏蛋白胨固体培养基（、牛肉膏蛋白胨固体培养基（1.5%1.5%的琼脂）的琼脂）底层用底层用 ，100ml/100ml/组，装于组，装于250ml250ml三角瓶，三角瓶， （用于制备（用于制备6 6个无菌平板，倒薄一点）个无菌平板，倒薄一点） 4 4、上层用上层用5ml5ml牛肉膏蛋白胨半固体培养基（牛肉膏蛋白胨半固体培养基（0.8 %0.8 %的琼脂的琼脂 ），融化后分装于），融化后分装于15150mm15150mm试管中加塞包扎灭菌，试管中加塞包扎灭菌，6 6 支支/ /组；组； （教师已准备好）（教师已准备好） 5 5、1ml1ml无菌吸管无菌吸管 5 5支支/
3、/组。组。 实实 验验 内内 容容 二二 噬菌体知识介绍噬菌体知识介绍 一、几个重要概念一、几个重要概念 1 1、噬菌体：、噬菌体： 是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等 微生物的病毒，分布极广，个体很小，微生物的病毒，分布极广，个体很小， 在光学显微镜下看不见，需用电镜观察在光学显微镜下看不见，需用电镜观察 。 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌蝌 蚪形、微球形和丝形蚪形、微球形和丝形。大多数噬菌体呈。大多数噬菌体呈 蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。 2 2、噬菌斑：、噬菌斑： 在混浊的细菌菌面（
4、菌苔）上形成的透在混浊的细菌菌面（菌苔）上形成的透 明区域，是由噬菌体不断侵染宿主细胞明区域，是由噬菌体不断侵染宿主细胞 裂解形成的，其形状、大小不等。裂解形成的，其形状、大小不等。 3 3、噬菌体效价：、噬菌体效价： 指指1mL1mL样品中所含具有侵染活性的噬菌样品中所含具有侵染活性的噬菌 体（烈性噬菌体）数量体（烈性噬菌体）数量噬菌斑形成噬菌斑形成 单位（单位（pfupfu，plaque-forming unitplaque-forming unit）。）。 效价（效价（titretitre，titertiter）这一名词在不同的）这一名词在不同的 场合有其不同的含义（如抗生素等）场合有其
5、不同的含义（如抗生素等）。 二、病毒粒子的构造（模型）二、病毒粒子的构造（模型） 噬菌体的形态及分类科属噬菌体的形态及分类科属 大肠杆菌大肠杆菌T4T4噬菌体结构示意噬菌体结构示意 图图 大肠杆菌大肠杆菌T4T4噬菌体结构示意图噬菌体结构示意图 及电镜照片及电镜照片 头部 六角形基板 领环 螺旋形尾鞘 核心或管 （中空） 尾刺或刺突 尾丝 噬菌斑示意照片噬菌斑示意照片 宿主细 菌菌苔 噬菌斑 大肠杆菌大肠杆菌T T噬菌斑的表型形态噬菌斑的表型形态 三、噬菌体的分类三、噬菌体的分类 根据噬菌体与宿主菌的相互关系根据噬菌体与宿主菌的相互关系 烈性噬菌体（烈性噬菌体（virulent phagevi
6、rulent phage） 能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬 菌体，并最终裂解细菌。菌体，并最终裂解细菌。 温和噬菌体（温和噬菌体（temperate phagetemperate phage） 噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代 噬菌体，但噬菌体噬菌体，但噬菌体DNADNA能随细菌能随细菌DNADNA复制，复制， 并随细菌的分裂而传代，存在游离态、整合并随细菌的分裂而传代，存在游离态、整合 态、营养态三种形式。态、营养态三种形式。 针对温和噬菌体来说：前（原）噬菌体针对温和噬菌体来说：前（原）噬菌体 、溶源
7、菌、溶源菌 四、噬菌体繁殖（生活周期）四、噬菌体繁殖（生活周期） 1 1、吸附、吸附 2 2、侵入、侵入 3 3、增殖（生物合成）、增殖（生物合成） 4 4、成熟装配、成熟装配 5 5、裂解释放、裂解释放 T4T4噬菌体吸附和噬菌体吸附和DNADNA的注入的注入 T T偶数噬菌体感染大肠杆菌偶数噬菌体感染大肠杆菌 的扫描电镜照片的扫描电镜照片 T4T4噬菌体的生活周期噬菌体的生活周期 T4T4噬菌体的装配噬菌体的装配 五、噬菌体的应用五、噬菌体的应用 1 1、细菌的鉴定与分型、细菌的鉴定与分型 噬菌体与宿主菌的关系具有高度特异性，噬菌体与宿主菌的关系具有高度特异性， 即一种噬菌体只能裂解一种和
8、它相应的细即一种噬菌体只能裂解一种和它相应的细 菌，故可用于未知细菌的鉴定和分型。菌，故可用于未知细菌的鉴定和分型。 2 2、遗传学及分子生物学研究的重要工具、遗传学及分子生物学研究的重要工具 噬菌体基因数量少，结构比细菌和高等细噬菌体基因数量少，结构比细菌和高等细 胞简单得多，且易获得大量的突变体胞简单得多，且易获得大量的突变体 构建基因文库（构建基因文库（ 噬菌体）；基因工程载噬菌体）；基因工程载 体；噬菌体展示技术。体；噬菌体展示技术。 3 3、细菌感染的诊断与治疗、细菌感染的诊断与治疗 利用其专一性，可以诊断和治疗一些利用其专一性，可以诊断和治疗一些 相关细菌感染性疾病（用于治疗时，其
9、相关细菌感染性疾病（用于治疗时，其 分泌的细菌素也可以应用，临床外伤治分泌的细菌素也可以应用，临床外伤治 疗已有应用）疗已有应用） 但专一性也限制了噬菌体在临床上的但专一性也限制了噬菌体在临床上的 广泛应用（人们最需要的是广谱性）。广泛应用（人们最需要的是广谱性）。 六、噬菌体的危害六、噬菌体的危害 在工业上会造成所培养菌体的大量裂解，使在工业上会造成所培养菌体的大量裂解，使 生产难以完成。生产难以完成。 表现形式：表现形式：发酵周期明显延长；发酵周期明显延长；碳源消碳源消 耗缓慢；耗缓慢；发酵液变清，镜检时，有大量异发酵液变清，镜检时，有大量异 常菌体出现；常菌体出现；发酵产物的形成缓慢或根
10、本发酵产物的形成缓慢或根本 不形成；不形成；用敏感菌作平板检查时，出现大用敏感菌作平板检查时，出现大 量噬菌斑；量噬菌斑；用电子显微镜观察时，可见到用电子显微镜观察时，可见到 有无数噬菌体粒子存在。有无数噬菌体粒子存在。 轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量 ，重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产。，重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产。 七、以防为主的措施：七、以防为主的措施： 1 1、决不使用可疑菌种；、决不使用可疑菌种； 2 2、严格保持环境卫生；、严格保持环境卫生； 3 3、决不排放或随便丢弃活菌液；、决不排放或随便丢弃活菌液； 4 4、注意通气质量、注意通
11、气质量 空气过滤器要保证质量并经常空气过滤器要保证质量并经常 进行严格灭菌，空气压缩机的取风口应设在进行严格灭菌，空气压缩机的取风口应设在3030 4040米高空；米高空； 5 5、加强管道及发酵罐的灭菌；、加强管道及发酵罐的灭菌； 6 6、不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种；、不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种； 7 7、严格执行会客制度。、严格执行会客制度。 实实 验验 内内 容容 三三 噬菌体效价的测定噬菌体效价的测定 一、噬菌体效价测定的方法一、噬菌体效价测定的方法 （梯度稀释）（梯度稀释） 斑点试验法斑点试验法涂菌平板上滴加稀释液涂菌平板上滴加稀释液 液体稀释试管法液体稀释试管法
12、以不长菌判断（澄清）以不长菌判断（澄清） 双层平板法双层平板法最常用，相对单层优点较多最常用，相对单层优点较多 单层平板法单层平板法 载玻片法载玻片法快速快速 其它病毒的效价（计数）测定其它病毒的效价（计数）测定空斑计数空斑计数 、电子显微镜直接计数、电子显微镜直接计数、免疫学间接测定（免疫学间接测定（ 凝集、凝集、ELISAELISA酶标仪）酶标仪）滴度表示滴度表示 噬菌体效价测定的方法噬菌体效价测定的方法 二、双层平板法二、双层平板法 二、双层平板法二、双层平板法 37 约4hr 双层平板法 双层平板法（1.5%琼脂培养基10mL） 双层平板法 宿主菌悬液（对数期菌液0.9mL） 噬菌体菌
13、悬液（合适稀释液0.1mL） 上层培养基（0.8%琼脂培养基5mL） 混匀 计数 单层与双层平板法所形成的噬菌斑的比较单层与双层平板法所形成的噬菌斑的比较 双层平板法的优点：双层平板法的优点： 加了底层培养基后，可使原来底面不平加了底层培养基后，可使原来底面不平 的玻璃皿的缺陷得到了弥补；的玻璃皿的缺陷得到了弥补； 所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平 面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近 、边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑、边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑 的重叠现象；的重叠现象； 因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬因上层培养基
14、中琼脂较稀，故形成的噬 菌斑较大，更有利于计数。菌斑较大，更有利于计数。 三、实验原理三、实验原理 一个噬菌体一个噬菌体侵染宿主细胞侵染宿主细胞引起裂解引起裂解 扩散重复侵染裂解扩散重复侵染裂解形成一个噬菌斑形成一个噬菌斑 （琼脂凝胶中）（琼脂凝胶中） 宿主细胞数远远大于噬菌体数？宿主细胞数远远大于噬菌体数？ 噬菌体效价（噬菌体效价（pfupfu/ml/ml）= = 噬菌斑数噬菌斑数1010稀释倍数稀释倍数 四、实验步骤 1 1、制备底层平板、制备底层平板 将已灭菌融化的牛肉膏蛋白胨固体培将已灭菌融化的牛肉膏蛋白胨固体培 养基平板养基平板6 6个（倒薄一些），凝固。个（倒薄一些），凝固。 2
15、2、加入大肠杆菌敏感菌、加入大肠杆菌敏感菌 在每个牛肉膏蛋白胨固体培养基平板在每个牛肉膏蛋白胨固体培养基平板 上，无菌条件下，各皿加入敏感菌菌悬液上，无菌条件下，各皿加入敏感菌菌悬液 0.9mL0.9mL。 3 3、稀释噬菌体、稀释噬菌体 取取1mL1mL含噬菌体液加入到含噬菌体液加入到 9mL9mL牛肉牛肉 膏蛋白胨培养液中，采用膏蛋白胨培养液中，采用1010倍稀释法，倍稀释法， 分别制备噬菌体稀释液（分别制备噬菌体稀释液（1010-7 -7、 、 1010-8 -8 、 、 1010-9 -9 ）。 ）。 4 4、噬菌体与大肠杆菌敏感菌混合、噬菌体与大肠杆菌敏感菌混合 将已加有大肠杆菌敏感菌将已加有大肠杆菌敏感菌6 6皿平板皿平板 （ 1010-7 -7 、 、 1010-8 -8 、 、 1010-9 -9各 各2 2皿）中，分别皿）中，分别 加入加入0.1mL0.1mL噬菌体稀释液，混合后放置噬菌体稀释液，混合后放置5 5 分钟。分钟。 5 5、加入上层培养基、加入上
