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1、实验九 用生长谱法测定微生物的营养需求一、 实验目的1、学习并掌握生长谱法测定微生物营养需要的基本原理和方法2、进一步巩固培养基的配制及灭菌二、实验原理微生物的生长繁殖需要适宜的营养环境，碳源、氮源、无机盐、微量元素、生长因子等都是微生物生长所必需，缺少其中一种，微生物便不能正常生长、繁殖。在实验室条件下，人们通常用人工配制的培养基来培养微生物，这些培养基中含有微生物生长所需的各种营养成分。如果人工配制一种缺乏某种营养物质（例如碳源）的琼脂培养基，接入菌种混合后倒平板，再将所缺乏的营养物质（各种碳源）点植于平板上，在适宜的条件下培养后，如果接种的这种微生物能够利用某种碳源，就会在点植的该种碳源
2、物质周围生长繁殖，呈现出许多小菌落组成圆形区域（菌落全），而该微生物不能利用的碳源周围就不会有微生物的生长。最终在平板上呈现一定的生长图形。由于不同类型微生物利用不同营养物质的能力不同，它们在点植有不同营养物质的平板上的 图形就会有差别，具有不同的生长谱，故称此方法为生长谱法。该法可以定性、定量地测定微生物对各种营养物质的要求，在微生物育种、营养缺陷型鉴定以及饮食制品质量检测等诸多方面具有重要用途。三、实验器材1.菌种 大肠杆菌2培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，琼脂15-20g,水10000ml，pH值 7.0-7.2 121灭菌20min，待用。（部分
3、分装试管约4捆，用于接种大肠杆菌制备菌悬液）合成培养基：（NH4）3 PO4 1g 、KCl 0.2g 、MgSO4.7H2O 0.2g 豆芽汁10ml、琼脂 20g、蒸馏水1000ml pH 7.0 加12ml0.04%的溴甲酚紫（pH 5.2-6.8，颜色由黄变紫，作为指示剂）。0.1MPa,121灭菌20min，待用。3. 糖溶液分别配制10%（m/v）的木糖、葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖溶液50ml（三角烧瓶或试剂瓶装）。即称取各种糖5g，加45ml蒸馏水。0.1MPa,105灭菌15min。4.糖浸片4.1 圆形滤纸片的制作 用圆形打孔器 (d=0.8 cm) 将重叠好
4、的滤纸打成圆形片，将打好的滤纸圆形片用牛皮纸包好（可包多层），121灭菌20min，待用。4.2 糖浸片的制备 将灭菌好的滤纸圆形片置入不同糖的溶液中浸泡10 min后，小心取出分别置无菌培养皿中，盖好后于28培养箱中烘干备用，最后置超净工作台上（开紫外灯状态）紫外照射20-30min。5. 溶液或试剂 100ml无菌生理盐水或无菌水两瓶。0.1MPa,121灭菌20min，待用。6. 仪器及其他用具超净工作台、手提式压力蒸汽灭菌锅、电子天平、无菌平皿、75%酒精等。四、实验内容（步骤） 1、大肠杆菌菌悬液的制备取培养24h的大肠杆菌斜面（或平板），用3-5ml无菌生理盐水（每支试管斜面）洗下
5、，制成菌悬液。2、平板的制备取灭菌好的合成培养基熔化并冷却至50左右，将制备好的菌悬液于倒入培养基中（菌悬液的加入量按培养基体积的0.1%加入，如：400ml培养基，加入4ml菌悬液），充分混匀，倒平板。待培养基凝固后，在平皿底用记号笔将平皿均分为三个区域，同时标明要点植的各种糖的名称，皿盖注明班级、组别，如图所示：备注：图中A、B、C、D、E、F分别代表木糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖糖浸片。3、糖滤纸片的加入在超净工作台上酒精灯火焰处用无菌镊子分别取蘸有不同糖类的滤纸片于相应的糖点植位置。4、待平板吸收干燥后，倒置于37恒温培养箱倒置培养1824h，观察生长情况，记录各种糖周围有无
6、生长圈，并测量生长圈的大小。 注意事项： 1.做实验之前要想好要准备哪些东西，准备多少；菌时要想好要灭哪些东西，要灭多少。 2.要严格无菌操作。3.加入菌悬液后要趁培养基尚未凝固及时倒平板，否则将会出现平板尚未倒好培养基已经凝固于三角瓶中。4.放滤纸片时要对号入座并轻轻按压，以免在进行倒置培养时糖片脱离培养基平板，也可防止交叉污染。五、实验结果以6中不同糖作为碳源，测定大肠杆菌对其利用情况，以滤纸片周围是否出现生长圈为判断标准，并记录结果。表1：不同碳源大肠杆菌的生长状况菌落生长情况培养皿碳源类型木糖葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖果糖菌落是否生长培养皿1培养皿2菌落颜色培养皿1培养皿2菌落大小（mm）培养皿1培养皿2备注：菌落生长用“+”表示，菌落不生长用“”表示。六、结果分析窗体底端窗体底端
