《枸杞多糖对糖尿病大鼠血—视网膜屏障的保护作用及rock通路表达的机理研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《枸杞多糖对糖尿病大鼠血—视网膜屏障的保护作用及rock通路表达的机理研究（114页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、辽宁中医药大学 硕士学位论文 枸杞多糖对糖尿病大鼠血视网膜屏障的保护作用及ROCK通路 表达的机理研究 姓名：王继红 申请学位级别：硕士 专业：中西医结合基础 指导教师：刘学政 20100401 辽宁中医药大学2 0 1 0 届博士学位论文 摘要 目的：明确枸杞多糖( L B P ) 对糖尿病大鼠血一视网膜屏障的保护作用，进一 步探讨枸杞多糖通过调控R O C K 信号通路及其底物P - M L C 的表达，减少血一视网膜 屏障渗漏的作用机制。 材料与方法：实验一取健康雄性s D 大鼠6 0 只，随机分为3 组：C O N 组：正 常对照组；D M 组：S T Z 造模；L B P 组：S T
2、 Z 造模成模后予以L B P ( 2 5 0 m g K g d ) 灌胃，D M 组予以等量的生理盐水灌胃。分别于4 W 、8 w 、1 2 w 抽取静脉血，并取眼 球。观察大鼠的一般情况；记录各时间点各组大鼠体重变化、血糖值及甘油三酯 和胆固醇的浓度；伊文思蓝( E B ) 4 5m g k g 尾静脉注入，分别检测视网膜中朗含 量。实验二健康成年雄性( S D ) 大鼠5 4 只，分组及给药方法取材时间同实验一， 采用H E 染色光镜观察各组大鼠视网膜各层组织细胞数量及形态变化。血管铺片形 态学观察：视网膜动静脉的形态、管径，同时采取免疫组化方法，检测视网膜血 管网V E G F 的表
3、达及狄度值半定量分析，采用透射电镜技术观察视网膜毛细血管内 皮细胞、周细胞及感光细胞超微结构。实验三健康成年雄性( S D ) 大鼠4 4 只， 随机分为5 组，C O N 组、D M 组、L B P 组给药方法取材时间同实验一，F 组：成模后 法舒地尔( F a s u d i l ) 腹腔注射( 1 5 m g k g ) ，L + F 组：成模后L B P 灌胃+ F a s u d i l 腹腔注射，各组于8 w 取材。分别用免疫组织化学方法检测O c c l u d i n 、R O C K l 表达 情况进行半定量分析。免疫印迹方法检测O c c l u d i n 、R O C
4、K 及其底物P - M L C 蛋白表 达的量，并利用凝胶成像系统对其进行定量分析。实验四实验细胞R F 6 A ，M E M 培养基继续培养4 8 h ，按照1 ：2 1 ：4 进行传代。分组检测：共分5 组，正常对照 组：含葡萄糖5 5 m m o l L ；高糖1 组：含葡萄糖3 0 m m o l L ；高糖2 组：含葡萄糖 4 0 m m o l L ；L B P + 高糖1 组：含葡萄糖3 0 m m o l L + L B P ( 1 9 L ) ：L B P + 高糖2 组： 含葡萄糖4 0 r e t o o l L + L B P ( 1 9 L ) ：于1 d 、3 d
5、、5 d 、7 d 进行指标检测。倒置显微 镜下观察细胞形态的变化；以辣根过氧化酶( H R P ) 作示踪剂用二室弥散系统检测 R F 6 A 单层通透性，免疫荧光法观察细胞骨架的变化、W e s t e r nb l o t 检测R O C K l 、 O c c l u d i n 和P - M L C 的蛋白表达量，并进行半定量分析。 结果： 1 L B P 对D M 大鼠血糖、血脂及血一视网膜屏障渗漏的影响： 3 枸杞多糖对糖尿病大鼠血一视网膜屏障的保护作用及R O C K 通路表达的机理研究 ( 1 ) 血糖变化：L B P 干预后的各组大鼠对应同时期的D M 大鼠的血糖均有明显下
6、降， 4 w 时血糖下降幅度为5 7 ，8 w 时下降幅度为4 0 ，1 2 w 血糖下降幅度为3 6 ，其降 血糖效果以4 w 最为明显，随着病情的进展L B P 的降糖效果有所减弱，下降率基本 稳定在3 5 4 0 之间。 ( 2 ) 体重的变化：D M 组成模后，开始出现消瘦，体重下降或增加缓慢，明显低于 相同时间段的其他两组大鼠的体重。而L B P 组则体重与正常对照组比较略有下降， 明显好于D M 组。 ( 3 ) 血脂的变化：D M 组1 2 w 时甘油三酯基本达到正常值的3 倍，而L B P 组1 2 w 时 甘油三酯的浓度有轻度上升。1 2 w 时D M 组总胆固醇浓度是正常对
7、照组的1 4 倍； 而L B P 组胆固醇浓度与正常组基本无差异少O 0 5 。 ( 4 ) E B 在血一视网膜屏障渗漏的变化：D M 组大鼠E B 渗漏量4 w 、8W 、1 2W 分别 增加了2 1 倍、2 3 倍、2 7 倍。而枸杞多糖组较糖尿病组以上三个时间点E B 渗 透量降低了5 0 、4 0 、2 7 ，组间比较仄0 0 1 。前4 w 保护作用表现就的最明显。 2 L B P 对D M 大鼠血一视网膜屏障形态学变化的影响： ( 1 ) H E 染色光镜观察：1 2 w D M 组神经纤维层断裂明显；节细胞、内颗粒层细胞排 列明显紊乱；毛细血管明显扩张，数量增加。4 w L B
8、 P 组、8 w L B P 组各层组织形态与 正常组织基本无明显差别，1 2 w L B P 组仅出现内、外颗粒层排列稍有不规则，毛细 血管的轻度扩张。 ( 2 ) 视网膜血管铺片：1 2 wD M 组毛细血管网迂曲，扭结，某些部位出现节段性膨 大，管腔狭窄甚至闭塞。周细胞和内皮细胞有所减少；1 2 w C O N 、D M 、L B P 组V E G F 灰度值2 1 6 1 3 2 7 1 、1 0 5 3 0 4 2 5 、1 7 6 7 2 4 3 1 。组间有明显差异仄0 0 5 ， D M 组并随着病程的进展，V E G F 表达的量不断增高。 ( 3 ) 电镜下超微结构的改变：
9、1 2 wD M 组大鼠视网膜基底膜进一步增厚，血管内皮 细胞及周细胞肿胀，胞质内线粒体肿胀变性，管腔可出现扩张。视杆细胞膜盘模 糊，出现溶解、断裂，间隙进一步扩大。1 2 wL B P 胞质内部分线粒体轻度肿胀变 性，基底膜增厚不明显，毛细血管壁完整，管腔无扩张。视杆细胞，膜盘结构略 有些模糊，结构开始出现紊乱，但纹理尚清。 3 枸杞多糖对糖尿病大鼠血一视网膜屏障保护作用机理的研究： ( 1 ) 免疫组化法检测的O c c l u d i n 表达：主要分布在视网膜内五层上。灰度值1 2 w 4 辽宁中医药大学2 0 1 0 届博士学位论文 时，C o N 组1 4 3 7 0 2 2 9
10、；D M 组1 7 3 1 8 3 7 8 ；L B P 组1 5 3 0 2 3 5 9 ，D M 组 表达较正常对照组显著减少。随着糖尿病视网膜病变时间的延长而逐渐下降。8 w 各治疗组与D M 组比较，O c c l u d i n 表达量明显增加。F + L 组效果最好( 仄0 0 5 ) ， L B P 与F a s u d i l 组之间无明显差异( p 0 0 1 ) 。 ( 2 ) 免疫组化法检测的R O C K l 表达：主要分布在神经节细胞层和内颗粒层，灰度值 1 2 w 时，C O N 组1 7 8 3 2 5 9 2 ；D M 组1 5 5 9 1 2 7 6 ；L B
11、 P 组1 7 8 8 2 4 3 3 ，D M 组从4 w 开始减弱，并随着病程的延长，R O C K l 表达的量逐渐增加，而L B P 组R O C K 表达量并没有明显的增加。各治疗组间比较，F + L 组与正常组无明显差异( 少0 0 5 ) ， 治疗效果最好，F a s u d i l 组的作用要比L B P 的效果明显一些( 仄O 0 5 ) 。 ( 3 ) 免疫印迹法检测O c c l u d i n 蛋白表达：D M 组随着病程的延长，O c c l u d i n 蛋白 的量逐渐下降，组间有明显差异仄0 0 1 ，而L B P 组3 5 7 0 5 8 ：F 组3 6 5
12、0 7 1 ； F + L 组4 4 8 0 5 3 ，L B P 组与F 组比较L B P 组表达略低，但无明显统计学意义 P O 0 5 。F + L 组表达量高于其他两治疗组仄0 O l ，与C O N 组相接近。 ( 4 ) 免疫印迹法检测R O C K l 蛋白表达：各组D M 组大鼠R O C K 蛋白表达随着病程的延 长量逐渐上升，组间有明显差异仄O 0 1 ；而L B P 组3 1 4 0 5 1 ；F 组3 0 5 0 4 2 ： F + L 组2 6 2 0 5 1 ，L B P 组与F 组比较L B P 组表达略高，有统计学意义p O 0 5 ( 4 ) T h el e
13、 a k a g eo fE Bi nd i f f e r e n tg r o u p s ：T h es t a n d a r dc u r v ef o r m u l a w a sc a l c u l a t e d ：y = O 0 8 1 8 x + 0 0 0 2 3 t h ea m o u n to fE Bl e a k a g eD Mg r o u pr a t s w e r eh i g h e r2 1 ，2 3 ，2 7 t i m e st h a nt h ec o n t r o lg r o u pr a t si n4 w ，8 w ，1 2
14、w r e s p e c t i v e l y B u tt h ea m o u n to fL B Pg r o u p Sw e r ed e c r e a s e d5 0 、4 0 、 2 7 ，c o m p a r i s o na m o n gg r o u p sw e r es i g n i f i c a n c eP O 0 1 T h ep r o t e c t i o nw e r e s i g n i f i c a n ta tf i r s t4 w 2T h em o r p h o l o g yc h a n g e so fL B Po
15、nB R Bi nd i a b e t e sr a t s ( 1 ) T h es a m p l e sw e r es t a i n e dw i t h ( H E ) t oe x a m i n et h em o r p h o l o g yc h a n g e s ： 1 2 wD R g r o u p ：n e r v ef i b e r l a y e rr u p t u r eo b v i o u s l y ：g a n g l i o nc e l l sa n d i n t e r n a lg r a n u l a rl a y e rc e
16、 l l s d i s o r d e d ，m i c r a n g i u mo b v i o u s l ye x p a n d ， v e s s e lw a llb e c a m et h ic k e r ，t h ea m o u n to fm ic r a n g i u mi n c r e a s e d E v e r yl a y e r m o r p h o u sw e r e s a m ea sn o r m a lt i s s u ei n4 w L B P ，8 w L B Pg r o u p s ，o n l yi n n e ra n e e x t e r n ag r a n u l a rl a y e rc e l l sb e c a m ea n o m a l i s ml
