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1、四川大学 博士学位论文 枯草芽孢杆菌植酸酶phyC基因的克隆及其表达研究 姓名：吴琦 申请学位级别：博士 专业：遗传学 指导教师：刘世贵 20040428 四川大学博士学位论文 枯草芽抱杆菌植酸酶 1) 加 基因的克隆及其表达研究 遗传学专业 博士研究生:吴琦指导教师:刘世贵( 教授) 王红宁( 教授) 植酸酶作为一种绿色添加剂，已日益广泛使用于饲料工业中。研究表明， 来源于芽抱杆菌的植酸酶属于中性植酸酶不仅具有较好的热稳定性，有助于抵 抗饲料制粒或者膨化过程中引起的酶失活，而且其酶促反应的p H有效作用范 围在6 . 5 -7 . 5 之间， 适合用于消化道呈中性的鲤科鱼类， 以及在单胃动物
2、中p H 值呈中性的肠道段中表现酶活力。目前，国内外尚无商品化的中性植酸酶投入 市场。 本研究从己筛选获得的中性植酸酶产酶菌株枯草芽抱杆菌 ( B a c i l l u s s u b t i l i s ) W H N B 0 2 出 发， 根据G e n B a n k 上的芽抱杆菌p h y C 基因 序列设计了 一对引物，采用 P C R法获得芽抱杆菌植酸酶的全长 p h y C 基因，并将其克隆到 p U C 1 8 一载体。序列分析表明，该基因全长 1 1 5 2 b p ，编码一个3 8 3 氨基酸的多 肤。通过与G e n B a n k 中登录的其他6 个植酸酶基因的核酸序
3、列和氨基酸序列进 行比较，建立了系统进化树，结果表明:所有芽抱杆菌植酸酶具有较高的同源 性，来源于7 株芽抱杆菌的植酸酶在遗传上分为两大类。利用在线生物信息学 数据库及生物软件对本基因进行了信号肚序列、N - 糖基化位点、密码子偏爱性 等分析， 并对其二级结构、 疏水区和三维结构进行了预测。 B . s u b t i l i s W H N B 0 2 植酸酶 p h y C基因序列及其氨基酸序列在 G e n B a n k中登录，登录号分别为 A F 2 2 0 0 7 5 和 A A 0 4 3 4 3 4 . 1 根据芽抱杆菌植酸酶p h y C 基因序列及大肠杆菌表达载体P E 丁
4、 一 3 0 b ( +) 多克 隆位点序列， 采用P C R 法获得不含有信号肤序列的植酸酶p h y C 基因的非融合和 融合表达片段。经克隆及序列测定后，构建了带有 T 7 1 a c 启动子的大肠杆菌的 植酸酶p E T 3 0 N F p h y C 和p E T 3 0 F p h y C 表达载体， 并转入大肠杆菌B L 2 1 ( D E 3 ) ， 实 四川大学博士学位论文 现了有生物学活性的表达。 研究了诱导温度、 I P T G 诱导浓度和乳糖诱导浓度对 植酸酶非融合和融合表达的影响，并对表达目的蛋白的可溶性进行了分析。结 果表明，非融合表达在3 7 和3 0 表达产物以
5、包含体形式存在，无表观酶活， 而 2 5 诱导的表观酶活最高;融合表达载体在 3 7 表观酶活较低，而 3 0 诱 导的表观酶活最高。表明降低诱导温度有助于实现目的蛋白的可溶性表达。两 种表达方式的工 P T G 最适诱导浓度为0 . 4 m m o l / L ，乳糖最适诱导浓度为1 YO，但 乳糖诱导表达的时间推迟 1 -2 h ， 且表达量不及I P T G 的诱导。 S D S - P A G E 分析表 明， 非融合和融合植酸酶的表达量分别约占菌体总蛋白的1 3 %和1 5 %， 分子量 分别为4 0 . 1 3 K D 和4 3 . 2 7 K D o 为实现芽抱杆菌植酸酶p h
6、y 基因的分泌表达， 以及由酵母翻译后加工可能 带来的酶学性质改善，首次进行了该基因在酵母中的表达研究。根据芽抱杆菌 植酸酶p h y c 基因序列及毕赤巴斯德酵母表达载体p P I C 3 . 5 K 和P P 工 C 9 K 多克隆位 点序列， 采用P C R 法获得不含有信号肤序列的植酸酶p h y 基因胞内表达和分泌 表达片段。经克隆及序列测定后，构建了重组表达载体 p P I C 3 . 5 K p h y C和 p P I C 9 K p h y C ，经 B g l 1 1 线性化后，电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌 G S 1 1 5 。经 MD和MM平板筛选、P C R检测和酶活性
7、测定，获得阳性重组酵母，首次在毕 赤巴斯德酵母中实现了有生物学活性芽抱杆菌植酸酶的胞内表达和分泌表达。 S D S - P A G E分析表明，胞内植酸酶表达量约占菌体总可溶性蛋白的2 4 ， 分子 量为4 2 . 0 1 K D;而分泌表达的植酸酶为5 3 . 5 K D 和5 0 . 9 K D 两种分子量的蛋白， 去糖基化试验证明这是由于产物糖基化程度不同引起的糖蛋白。用麦芽汁半合 成培养基对分泌表达重组酵母进行培养， 经4 8 h 诱导酶活可达到2 4 5 3 U / m l ， 表 达量为出发菌株的1 0 . 5 倍。 将本研究获得的芽抱杆菌植酸酶的4 种基因工程菌表达产物，即大肠杆
8、菌 表达的非融合植酸酶和融合植酸酶、酵母胞内表达的植酸酶和分泌表达的植酸 酶， 通过初步纯化后， 对其最适反应温度、 热稳定性和最适反应p H 值进行了测 定。结果表明，4 种基因工程植酸酶的最适反应温度分别为5 5 0C , 7 5 0C, 7 0 0C 和6 5 C，与天然植酸酶相比，分别降低了5 和增加了1 5 0C, 1 0 和5 0C 。热 稳定性测定表明，经7 5 处理时，4 种基因工程植酸酶分别表现为酶活急剧下 降，几乎没有损失，损失较小和几乎没有损失:在 9 0 水浴 5 m i n 和 1 0 m i n 后 四川大 学博士学位论文 的残留酶活性分别为 4 3 . 8 %和
9、3 5 . 5 %, 9 4 . 9 %和 7 5 . 7 %, 5 4 .6 %和 4 2 .2 %, 以及8 8 . 0 %和7 8 . 2 %， 均比天然植酸酶的有所提高0 4 种基因工程植酸酶的最 适反应p H分别为7 . 0 , 7 . 5 , 7 . 5 和7 . 0 , 催化效率在7 0 %以 上的 有效反应p H范 围分别为p H 5 . 5 - 8 , p H 5 . 5 - 9 , p H 6 . 5 - 9 和p B 6 - 8 ，比天然植酸酶的 扩大了0 . 5 - 1 个P H . 关键词: 枯草芽抱杆菌， 植酸酶， p h y C基因， 大肠杆菌， 毕赤巴斯德酵母，
10、 表达 四川大学博 上 学位论文 C l o n i n g a n d e x p r e s s i o n o f p h y t a s e p h y C g e n e f r o m Ba c i l l u s s u b t i l i s Ma j o r : G e n e t i c s P h . D . C a n d i d a t e : Wu Q i A d v i s o r s : P r o f . L i u S h i - g u i 另一方面，粪便中排出的大量的磷又 造成了对土壤和水源的污染。 磷存在于土壤表面， 不仅能在土壤中渗透和扩散， 还会与
11、铜、铝、钙等元素形成不溶性复合物而保留在土壤中.如果土壤中磷大 量积聚并溢出，将随着土壤的侵蚀流动，造成自 然界水体的污染。一些国家从 环保的角度对集约化畜牧场己 提出了限制排磷的要求。荷兰于 1 9 9 8年通过了 M I N A S( 一种新的矿物元素结帐系统) 的立法， 其中严格限制了动物粪便中磷酸 盐的排放量。此外，植酸盐通过鳌合作用还可降低动物对锌、锰、铁、钙、钾 等主要微量元素的利用率，通过与蛋白质结合成植酸复合体而降低动物对蛋白 质的消化吸收率，从而使整个饲料的利用率降低。 随着人们对绿色食品消费需求的增加和对畜牧业生产与过程中生态环境 保护的重视，饲用酶制剂以其高效、安全、低成
12、本等特点，已成为世界新型饲 料添加剂研究和应用的热点。植酸酶 ( P h y t a s e )即肌醇六磷酸水解酶 ( M y o - i n o s i t o l h e x a p h o s p h a t e p h o s p h o h y d r o t a s e ) . 是催化 植酸 ( 即 肌醇 六磷酸) 及植酸盐水解成肌醇与磷酸 ( 或磷酸盐)的一类酶的总称。大量研究表明， 在 猪、禽日粮中添加植酸酶，可使饲料中磷的利用率提高 4 0 - 6 0 %.粪便中磷 的排出量减少3 0 - 5 0 % 左右。目前全世界已公认，要提高饲料中植酸磷的利 用率，减少猪、禽粪便中植酸
13、磷对环境的污染，降低植酸磷对其它微量元 素及蛋白质利用率的影响，应用植酸酶是一种有效的方法。 目前，以对真菌来源的酸性植酸酶研究最多，目 前已构建各种基因工程菌 并得到高效表达，并进行了规模化发酵生产，大大提高了酶产量和降低生产成 本， 己 在饲料工业中 得到 广泛应用。 由 于酸性 植酸酶其酶催反 应的 有效作 用p H 四川人学博士学位论文 范围在2 . 5 - 5 . 5 之间，因此主要使用于P H值呈酸性的单胃动物及少数鱼类如红 鲜等，但不适合用于消化道呈中性的鲤科鱼类，以及在单胃动物中P H值接近 中性的肠道中表现酶活力。 随着水产养殖业的发展， 水体磷的污染越来越严重， 急需开发出
14、适于鱼类饲料用的植酸酶，这限制了酸性植酸酶的应用范围。研究 表明， 来源于芽抱杆菌的 植酸酶 属于中 性植酸酶 ( 3 - P h y t a s e , E C 3 . 1 ,3 .8 ) ， 不 仅具有较好的热稳定性，有助于抵抗饲料制粒或膨化过程中引起的酶失活，而 且其酶促反应的有效作用P H范围在6 .5 - 7 . 5 之间， 可以有效弥补酸性植酸酶的 不足。同时也可与真菌植酸酶混合使用，一个在胃中起作用，一个在肠道中起 作用，从而更有效地在单胃动物中水解植酸盐，提高植酸磷的利用率。 目 前，国内外己分离出多株产中性植酸酶的芽抱杆菌 ( B a c i l l u s )，克隆 了其植
15、酸酶基因， 并在此基础上进行了表达研究。 由于芽抱杆菌属于原核生物， 所以目前用于芽抱杆菌植酸酶基因的表达系统主要使用的是大肠杆菌表达系统 和芽抱杆菌表达系统，也有在乳酸杆菌中进行表达的研究。作为原核生物基因 的模式表达系统，用大肠杆菌表达芽抱杆菌植酸酶，具有培养简单、生长速度 快的特点，但由于其分泌表达较为困难和容易形成包含体等原因，使得酶产量 提高有限。用枯草芽抱杆菌表达芽抱杆菌植酸酶，具有生物活性好，胞外分泌 等特点， 特别是基于p s t 启动子的p G T 4 4 表达系统 不仅 有精密的表 达调控机制， 而且有表达效率高，是很有前途的一类表达系统。但培养较为复杂，而且其产 量还难以
16、用于实际的工业化生产，仍需进一步改造。此外，利用芽抱杆菌植酸 酶基因构建转基因植物，对于提高农学和园艺生产力是有意的尝试，但并不适 合作为生产本酶的生物发酵器。尽管目 前尚无将芽抱杆菌植酸酶在酵母表达系 统中进行表达的报道，但笔者认为，如果对芽袍杆菌植酸酶基因采取合适的改 造，借助成熟的酵母高效表达系统，是实现工业化生产芽抱杆菌植酸酶的必然 趋势。 作为用于饲料工业的酶制剂，由于饲料制粒工艺和动物生理生化的要求， 真正得到推广利用的植酸酶必须是具有良好热稳定性，同时又必须在动物正常 体温下具有较高的酶活性。 如何解决使其耐短暂制粒高温、又能在动物正常体 温下具有高酶活性这一对矛盾是目 前包括植酸酶在内的所有饲用酶制剂均需解 决的问题。此外，植酸酶催化的反应P H也必须与动物消化道相适应。不同的 四川大学博士学位论文 动物消化道的p H值不同，即使是一种动物在消化道的不同部位p H值也不同， 一般的p H值胃为1 . 5 - 3 .5 ，小肠为5 - 7 、
