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1、中山大学 博士学位论文 NADPH氧化酶4在糖尿病视网膜病变中作用及机制的研究 姓名：李晶明 申请学位级别：博士 专业：眼科学 指导教师：于强 20100523 中山大学博士学位论文N A D P H 氧化酶4 在糖尿病视网膜病变中作用及机制的研究 N A D P H 氧化酶4 在糖尿病视网膜病变中作用 及机制的研究 专业：眼科学 博士研究生：李晶明 导师：于强教授 中文摘要 目的 糖尿病视网膜病变( D R ) 是糖尿病常见的眼部并发症和致盲的主要原因之一。 炎症反应和氧化应激是D R 时内皮功能障碍、血管渗漏和新生血管形成的重要原 因。我们首先探讨了洛伐他汀( L o v a s t a
2、t i n ) 对D R 保护作用的抗炎及抗氧化机制； 同时阐明N A D P H 氧化酶4 ( N o x 4 ) 在糖尿病视网膜表达情况及其在D R 血管渗漏和 新生血管形成中的作用，并进一步探讨N A D P H 氧化酶4 作为视网膜血管内皮细胞 ( R E C s ) 内活性氧自由基( R O S ) 产生的主要来源对血管内皮细胞生长因子( V E G F ) 表达及V E G F 介导信号通路的影响。 方法 ( 1 ) L o v a s t a t i n 干预作用及机制研究：采用d b d b 小鼠作为D R 动物模型，1 9 周龄d b d b 小鼠按1 0m g ( k g
3、d ) 剂量给予L o v a s t a t i n 灌胃处理6 周。采用W e s t e r n b l o t 检测L o v a s t a t i n 干预对糖尿病视网膜血管白蛋白渗漏、紧密连接蛋白 O c c l u d i n 、前炎症因子如细胞间粘附分子1 ( I C A M 1 ) 和肿瘤坏死因子a ( T N F 一吣表 达以及N o x 4 和V E G F 产生的影响。采用缺氧( 2 0 2 ) 处理R E C s ，观察L o v a s t a t i n 对缺氧诱导的R E C s 中I C A M 1 和T N F a 表达的作用。将R E C s 和或人视网
4、膜色素 上皮细胞( A R P E 1 9 ) 暴露于T N F - a ，W e s t e r nb l o t 检测L o v a s t a t i n 处理对I C A M 1 及 O c c l u d i n 表达的作用，I C C 或D N A 结合活性分析检测L o v a s t a t i n 预处理对T N F - c t 诱导的核因子- r , B 活化的影响。R O S 敏感荧光探针C M H 2 D C F D A 检测L o v a s t a t i n I 中山大学博士学位论文N A D P H 氧化酶4 在糖尿病视网膜病变中作用及机制的研究 预处理对缺氧诱
5、导的R E C s 中R O S 产生的影响。给予下述氧化酶抑制剂预处理 R E C s ：N A D P H 氧化酶抑制剂( D P I ) 、一氧化氮合成酶抑制剂( L - N A M E ) 、黄嘌呤 氧化酶抑制剂( A l l o p u r i n o i ) 和线粒体电子传递链抑制剂( R o t e n o n e ) ，观察其对缺氧 诱导R O S 产生的抑制作用。实时定量R T P C R 检测R E C s 中N A D P H 氧化酶异构 体表达的主要形式。W e s t e r nb l o t 和或I C C 检测L o v a s t a t i n 对缺氧诱导R
6、E C s 中 N o x 4 表达定位以及V E G F 产生的影响。 ( 2 ) N o x 4 在D R 血管渗漏中作用及机制的研究：通过玻璃体腔内注射N o x 4 s i R N A 腺病毒( A d - N o x 4 i ) 敲除d b d b 小鼠视网膜N o x 4 表达，伊文思兰血管通透性 分析检测d b d b 小鼠视网膜血管的渗漏情况，新鲜全眼球冰冻切片R O S 敏感荧光 探针C M H 2 D C F D A 检测d b d b 小鼠视网膜N A D P H 氧化酶的活性，W e s t e r nb l o t 检 测d b d b 小鼠视网膜N o x 4 及V
7、 E G F 表达水平。显性负突变N o x 4 腺病毒( A d N o x 4 尉D ) 感染R E C s 抑制N o x 4 活性，用缺氧( 2 0 2 ) 或高糖( 2 5 m M ) 处理感染后 的R E C s ，W e s t e r nb l o t 检测V E G F 和H l F 1 吨或p - S T A T 3 的表达，R O S 敏感荧光探 针C M H E D C F D A 、D H E 和a m p l e xr e d 检测缺氧或高糖诱导的细胞内、外R O S 的 产生。野生型N o x 4 腺病毒( A d - N o x 4 a r ) 感染R E C
8、s ，C M H 2 D C F D A 和a m p l e xr e d 分别观察细胞内、外R O S 的产生，W e s t e r nb l o t 检测过表达N o x 4 对R E C s 中H I F I a 和V E G F 产生的影响。 ( 3 ) N o x 4 在视网膜新生血管形成中作用及机制研究：建立高氧诱导的新生鼠 视网膜病变模型( O I R ) 模拟糖尿病性视网膜新牛血管。W e s t e r nb l o t 和或E L I S A 检 测视网膜血管闭塞阶段( p 1 2 ) 和新生血管形成阶段( p 1 5 或p 1 7 ) 视网膜N o x 4 和 V E
9、 G F 表达水平。I H C 检测视网膜新牛血管形成高峰( p 1 7 ) 时N o x 4 在O I R 小鼠视 网膜的表达定位。通过球周注射A d - N o x 4 i 载体敲除O I R 小鼠视网膜N o x 4 的表 达，异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐( F I T C D e x t r a n ) 血管造影和视网膜铺片定量 O I R 小鼠无血管区形成，全眼球石蜡切片苏木素伊红( H E ) 染色计数O I R 小鼠视网 膜前新生血管核的数目评价O I R 小鼠视网膜新生血管形成的程度，W e s t e r nb l o t 检 测O I R 小鼠视网膜N o x 4 和V E
10、 G F 表达水平。A d - N o x 4 i 感染R E C s 从基因水平敲 除N o x 4 表达，将R E C s 暴露于缺氧( 2 0 2 ) ，W e s t e r nb l o t 检测H I F I 一( I t 和V E G F 的 表达，D H E 检测细胞内R O S 的产生。基质胶( M a t r i g e l ) 体外检测R E C s 的管腔形 I I 中山大学博二 二学位论文N A D P H 氧化酶4 在糖尿病视网膜病变r I 作用及机制的研究 成能力，跨膜迁移试验( T r a n s w e l la s s a y ) 评价R E C s 的移行
11、功能。此外，通过 W e s t e r nb l o t 检测N o x 4 对V E G F 介导的促分裂原活化激酶( M A P K ) 信号通路中 E R K l 2 和p 3 8 活化的作用。 结果 ( 1 ) 与同窝对照小鼠相比d b d b 小鼠视网膜N o x 4 表达上调并与I C A M 1 、T N F a 和V E G F 水平升高以及视网膜屏障破坏和血管渗漏相一致( p O 0 5 或p 0 o o 。 L o v a s t a t i n 处理后明显减轻d b d b 小鼠视网膜血管渗漏和抑制O c c l u d i n 表达下调并 降低I C A M l 、T
12、 N F a 、V E G F 和N o x 4 表达( p o 0 5 或p 0 0 1 ) 。体外研究发现 L o v a s t a t i n 处理明显抑制缺氧诱导的R E C s 中前炎症因子I C A M 1 和T N F 吨表达 ( p O 0 5 ) 。此外，我们还发现L o v a s t a t i n 处理抑制T N F I a 诱导的A R P E 1 9 中核因子 1 ( B 活化( p 0 0 5 ) 以及降低T N F 吨诱导的R E C s 和A P R E 1 9 中I C A M 1 的表达 ( p O 0 5 ) 。体外培养的R E C s 中，N o x
13、 4 的m R N A 水平高出其他N A D P H 氧化酶异构 体数百倍，其蛋白表达在R E C s 中呈核周分布并受缺氧调节，L o v a s t a t i n 处理后明 显抑制缺氧诱导N o x 4 和V E G F 的表达并降低缺氧介导的细胞内R O S 产生( p 0 0 5 或p 0 0 1 ) 。 ( 2 ) 玻璃体腔注射A d - N o x 4 i 从基因水平敲除N o x 4 的表达可以明显抑制d b d b 小鼠视网膜V E G F 的表达( p O 0 1 ) 、减少R O S 的产生( p O 0 5 ) 并缓解了视网膜血 管渗漏( p 0 0 5 ) 。感染A
14、 d - N o X 4 剐9 抑制N o x 4 活性分别通过H 1 F I a 和p - S T A T 3 依 赖的机制抑制缺氧或高糖诱导的R E C s 中R O S 产生和V E G F 表达( p 0 0 l 或 p 0 0 5 ) 。感染A d - N o X 4 胛过表达N o x 4 显著升高R E C s 中R O S 的产生( p 0 0 1 ) 并 上调H I F I - d 和V E G F 的水平( p 0 0 5 ) 。 ( 3 ) O I R 小鼠高氧诱导的视网膜血管闭塞阶段N o x 4 表达下调( p O 0 5 ) 而视网 膜新生血管形成阶段N o x 4
15、 表达明显升高( p 0 0 1 ) ，与V E G F 表达变化趋势相一 致。免疫组织化学显示O I R 小鼠视网膜新生血管形成高峰N o x 4 主要表达于视网膜 内界膜玻璃体面的新生血管处，此外视网膜内核层及外丛状层处视网膜固有血管 N o x 4 表达也上调。应用A d - N o x 4 i 从基因水平敲除视网膜N o x 4 的表达可以明显抑 制O I R 小鼠视网膜无灌注区( p 0 0 5 ) 及新生血管的形成( p 0 0 1 ) 并降低视网膜 V E G F 的表达( p O 0 5 ) 。感染A d - N o x 4 i 后明显抑制缺氧诱导的R E C s 中R O S
16、 产生 I I I 中山大学博士学位论文 N A D P H 氧化酶4 在糖尿病视网膜病变中作用及机制的研究 ( p o 0 1 ) 以及H I F I - c t 和V E G F 表达。此外，感染A d - N o x 4 i 敲除R E C s 中N o x 4 表 达可以明显降低V E G F 诱导的R E C s 管腔形成( p 0 0 1 ) 和移行能力( p 0 0 1 ) 以及抑 制V E G F 诱导的E R K I 2 和p 3 8M A P K 磷酸化( p 0 0 5 ) 。 结论 L o v a s t a t i n 主要通过降低视网膜前炎症因子产生及抑制氧化应激反应发挥对糖 尿病血视网膜屏障功能的保护作用。N o x 4 作为R E C s 中R O S 产生的重要来源，其 在糖尿病视
