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1、中国医科大学 博士学位论文 Kv1.5及凋亡相关蛋白在氟西汀抗大鼠肺动脉高压作用中的机制 研究 姓名：翟凤国 申请学位级别：博士 专业：药理学 指导教师：王怀良 20090401 中文论著摘要 K v l 5 及凋亡相关蛋白在氟西汀抗大鼠肺动脉高压作 用中的机制研究 目的 肺动脉高压( P A H ) 是以肺动脉压持续性、渐进性增高，导致右心室肥厚、右心 衰竭并最终引起死亡为特征的一组疾病。肺动脉高压发病机制复杂，目前尚未明 确，可行的治疗方法有限、昂贵并伴有明显的副作用。P A H 具有复杂的病理改变， 主要包括肺血管收缩性增强、肺血管构型重建、肺小血管内微血栓形成以及肺组 织炎症反应。 在
2、肺动脉高压中，肺血管构型重建具有肺血管结构改变并伴有中膜肥厚的特 征。这主要是由于肺动脉平滑肌细胞( P A S M C s ) 增殖和凋亡失衡所致。已证明 P A S M C s 增殖增加和或P A S M C s 凋亡减少都可促进肺血管中膜肥厚和血管构型重 建。因此，肺动脉高压更有效的治疗将直接并选择性的针对导致肺血管平滑肌细 胞增殖增加和凋亡减少的机制。最近，以诱导细胞凋亡为基础来降低肺血管增厚 的治疗方法受到关注并在动物实验中获得成功。因此，抑制肺动脉平滑肌细胞增 殖和促进肺动脉平滑肌细胞凋亡可能成为人类肺动脉高压治疗的突破口。 近年来，国内外学者研究发现钾通道也可通过调节P A S
3、M C s 增殖和凋亡参与 肺血管构型重建。P A S M C s 中有多种l “通道表达，其中最重要的是K v l 5 。K v l 5 表达减少或活性降低不仅通过引发肺动脉平滑肌细胞膜去极化和增加胞浆钙离子 浓度引起肺血管收缩，而且还通过抑制细胞皱缩和凋亡促进肺血管中膜肥厚。反 之，K v l 5 表达增高或活性增强可增加肺动脉平滑肌细胞凋亡增殖比率并进而抑 制肺动脉高压。肺动脉高压患者和实验性肺动脉高压动物模型也显示K v l 5 表达 下调，对细胞凋亡的抵抗作用进一步增强。 肺动脉平滑肌细胞的增殖和凋亡被许多血管活性因子、生长因子和细胞因子 所调控。其中，5 一羟色胺( 5 - h y
4、 d r o x y t r y p t a m i n e , 5 - H T ) 是一个强有力的血管收缩 因子和促有丝分裂因子，在P A H 发病机制中具有重要作用。研究发现，肺动脉高 压患者血浆中5 H T 水平明显高于正常人，体外实验证明高浓度的5 H T 能使人离体 肺血管明显收缩。5 - H T 可经细胞膜上的5 一羟色胺转运体( 5 h y d r o x y t r a p t a m i n e t r a n s p o r t e r , 5 - H 1 1 ) 介导进入肺动脉平滑肌细胞，并通过多种增殖信号转导途径引 起P A S M C s 增殖肥大，导致肺血管构型重建
5、。5 - H T 也可以抑制K v l 5 电流。此外， 肺动脉高压患者肺动脉中5 H T T 表达增加，暴露在低氧条件下的P A S M C s5 H T T m R N A 表达也增加。越来越多的研究结果表明5 羟色胺和5 羟色胺转运体在肺动脉 高压发病机制中起关键作用。 选择性5 羟色胺再摄取抑制剂( S S R I s ) 包括氟西汀、舍曲林、帕罗西汀、西 肽普兰等，是近年来临床常用的抗抑郁症药物。它们通过阻断突触前膜上的 5 H T T ，抑制5 - H T 再摄取，提高突触间隙5 - H T 浓度，从而发挥治疗作用。我们 最近报道了氟西汀可在体外抑制5 - H T 介导的肺动脉平滑
6、肌细胞增殖。也有研究表 明氟西汀可抑制5 羟色胺对肺动脉平滑肌细胞K v 电流的影响并抑制肺血管收缩。 此外，氟西汀也保护慢性低氧诱导的肺血管构型重建和肺动脉高压。 氟西汀抗肺动脉高压的作用是否与它对K v l 5 通道及肺动脉平滑肌细胞增殖 和凋亡的调控有关均不清楚。因此在本研究中，我们通过建立野百合碱( M C T ) 诱导的慢性大鼠肺动脉高压模型来观察肺动脉平滑肌细胞的增殖、凋亡和K v l 5 在M C T 诱导的肺动脉高压中的作用，并探讨氟西汀抗肺动脉高压作用是否与这些 因素有关。 实验方法 ( 一) 建立肺动脉高压大鼠模型 体重( 1 6 04 - l O g ) 的雄性W i s
7、 t a r 大鼠8 0 只( 中国医科大学实验动物中心，G r a d e I I ，C e r t i f i c a t eN o 0 3 4 ) ，随机分成4 组：对照组( c o n t r 0 1 ) 、M C T 组、M C T + 氟西汀 2 m g k g 剂量组( M C T + F 2 ) 和M C T + 氟西汀1 0 m g l 【g 剂量组( M C T + F 1 0 ) 。M C T 组、M C T + F 2 组和M C T + F 1 0 组大鼠一次性腹腔内注射M C T6 0 m g k g ，对照组 注射同等剂量的溶剂。继而，M C T + F 2 组和
8、M C T + F 1 0 组大鼠每天分别给予氟 西汀2 m g k g 和1 0 m g k g 灌胃，M C T 组和对照组大鼠每天给予等量溶剂黄耆胶灌 胃。各组大鼠常规给予食物和水，保持温度( 1 8 0 C 一2 2 0 C ) 和湿度( 5 0 7 0 ) ，饲 养3 周。 ( 二) 大鼠肺动脉压、体循环压和右心室肥厚指数检测 给药2 1 天后，大鼠用3 戊巴比妥( 4 0 m g k g ) 经腹腔内注射麻醉，切开颈部皮 肤，分离右侧颈外静脉和颈总动脉。将微型聚乙烯导管插入右颈总动脉测量体循 环压( S A P ) ，将另一聚乙烯导管自右颈外静脉插入肺动脉测量肺动脉压( P A P
9、 ) ， 由压力传感器连至多导生理记录仪记录数据。经以上检测后将大鼠过量麻醉处死， 取出整个心脏，分离右心室( R V ) 和左心室+ 室间隔( L V + S ) ，分别称量R V 和 L V + S 的重量，R V ( L V + S ) 即为右心室肥厚指数( R V I ) 。 ( 三) 肺组织形态学检测 处死大鼠后，取大鼠右肺下叶固定于4 的多聚甲醛，常规石蜡包埋。将5 岬厚的大鼠肺动脉石蜡切片用H E 染色后，光学显微镜检测，并对肺小动脉血管 壁厚度进行统计学分析。每组取3 只大鼠，每只大鼠取外径在5 0 - - - 2 0 0 9 m 的2 0 个 肺肌型小动脉，测其内外径，用下面
10、公式估算肺血管壁厚度： 血管壁厚度= ( 血管外径血管内径) 血管外径X1 0 0 ( 四) 肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的检测 用免疫组化染色法检测P C N A 表达来观察肺动脉平滑肌细胞增殖情况；用 T U N E L 法检测肺动脉平滑肌细胞凋亡情况。每张切片随机计数1 0 个视野，在光 学显微镜( x 4 0 0 ) 下观察P C N A 和T U N E L 阳性细胞数。 ( 五) W e s t e r nB l o t 法检测各组大鼠肺动脉B c l 2 ，B c l x l ，C l e a v e d c a s p a s e 3 蛋白的表达 ( 六) R T - P C R
11、 法检测各组大鼠肺动脉K v l 5m R N A 的表达 ( 七) W e s t e r nB l o t 法检测各组大鼠肺动脉K v l 5 蛋白的表达 ( 八) 统计学分析 3 所有数据以m e a n4 - S D 表示，采用单因素方差分析。二组间差异采用L S D 法 检验。尸 O 0 5 时认为差异具有统计学意义。采用S P S S1 3 0 软件进行统计学分析。 实验结果 l 、血流动力学指标检测 与对照组相比，M C T 组大鼠平均肺动脉压从1 7 84 - 1 2m m H g 明显升高到3 2 7 4 - 5 7m m H g ( 尸 0 0 1 ) ；与M C T 组相
12、比，M C T + F 1 0 剂量组平均肺动脉压明显降 低，平均肺动脉压为2 5 84 - 5 4m m H g 俨 o 0 5 ) 。M C T + F 2 剂量组平均肺动脉压 比M C T 组低，但没有达到统计学意义。平均体循环压在各组间也无明显差异。 2 、右心室肥厚指数检测 与对照组相比，M C T 组右心室肥厚指数由3 4 1 4 - 2 1 明显增加到5 1 3 4 - 8 8 ( P O 0 1 ) ；氟西汀以剂量依赖性方式明显降低了M C T 引起的右心室肥厚 指数的增加，M C T + F 2 剂量组降至4 5 2 4 - 5 3 俨 0 0 5 ) ，M C T + F
13、1 0 剂量组 降至4 3 4 4 - 3 3 沪 0 0 1 ) 。 3 、肺组织形态学分析 肺组织H E 染色显示，对照组大鼠肺小动脉内皮细胞连续性好，细胞分布均 匀，管壁薄，管腔大且厚薄一致；M C T 组大鼠肺小动脉内皮细胞连续性破坏，细 胞肿胀、变性、坏死和脱落，血管中膜平滑肌细胞明显增生，管壁厚度明显增加， 管腔面积明显变小；与M C T 组相比，M C T + F 2 和M C T + F 1 0 剂量组大鼠肺小动 脉内皮细胞连续性较好、管壁厚度减小、管腔面积增大，且以M C T + F 1 0 组更为 明显。 与对照组相比，M C T 组肺小动脉血管壁明显增厚，管壁厚度由2 6
14、 9 4 - 7 1 增加至5 0 5 4 - 1 0 8 ( P 0 0 1 ) ：氟西汀剂量依赖性的降低了M C T 引起的肺血 管壁增厚，M C T + F 2 、M C T + F 1 0 剂量组管壁厚度分别由M C T 组5 0 5 4 - 1 0 8 降至4 6 0 4 - 8 2 ( P 0 0 1 ) 和3 6 6 4 - 7 0 俨 O 0 1 ) ( 图2 ，3 ) 。这些结果 表明M C T 可诱发明显的肺血管构型重建，氟西汀明显抑制了M C T 引起的肺血管 构型重建。 4 4 、氟西汀抑制肺血管平滑肌细胞增殖 与对照组相比，M C T 组肺动脉中膜血管平滑肌细胞中P
15、C N A 阳性细胞百分比 由3 7 4 - 1 2 明显增加到1 5 7 4 - 3 2 ( P O 0 1 ) 。与M C T 组相比，M C T + F 2 剂量组P C N A 阳性细胞百分比无明显改变，但M C T + F 1 0 剂量组明显抑制肺血管 平滑肌细胞增殖，P C N A 阳性细胞减少到8 2 4 - 2 8 俨 0 0 1 ) 。 5 、氟西汀增强肺血管平滑肌细胞的凋亡 与对照组相比，M C T 组肺动脉中膜血管平滑肌细胞中T U N E L 阳性细胞百分 比由3 3 4 - 1 3 略降低到2 9 4 - 1 1 俨 0 0 5 ) 。氟西汀剂量依赖性地增强 肺动脉平
16、滑肌细胞凋亡，与M C T 组相比，M C T + F 2 ，M C T + F 1 0 剂量组T U N E L 阳性细胞百分比分别增加至7 9 4 - 1 9 ( 尸 0 0 1 ) 和1 1 7 4 - 2 5 俨 0 0 1 ) 。 6 、肺动脉B c l 2 ，B c l x l 和C l e a v e dc a s p a s e 3 蛋白表达 用W e s t e r nb l o t 方法检测肺动脉B c l 一2 ，B c l x l 和C l e a v e dc a s p a s e 3 蛋白表达变 化。结果显示，与对照组相比，M C T 组肺动脉B c l 2 和B c l x l 蛋白表达明显增加， 分别由1 2 24 -
