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1、河北医科大学 1 8 3 3 5 8 3 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独立完成。本 学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北 医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文 主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，实验材料、原始 数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应 的法律责任。 研究生签字：奢重聊签章译碑级学院签誊。羔之 如，o 年g 月岁日 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文 中特别加以标注等内容外
2、，文中不包括其他人已经发表或撰写的研究成 果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究生签字：私童 刷币签甍r 知归年多月岁日 一1 目录 I I I IIII I II I III II IIII 18 0 7 8 6 4 中文摘要1 英文摘要8 英文缩写15 研究论文K L F 4 在转化生长因子p 1 诱导血管平滑肌细胞分化中的 作用及机制研究 引言l6 第一部分T G F - p 1 诱导V S M C 分化与上调K L F 4 和T p R I 表达有关 前言18 一再I J 舌l 材料与方法2 0 结果2 3 附图2 6 讨论3 4 小结3 6 参考文献3 7
3、 第二部分T G F p 1 通过激活S m a d 和p 3 8M A P K 信号通路诱导 K L F 4 磷酸化和K L F 4 与S m a d 2 3 相互作用 前言4l剐舌l 材料与方法4 2 结果4 5 附图一4 8 讨 仑5 8 小结5 9 参考文献6 0 第三部分K L F 4 与S m a d 2 协同激活T 3 R I 启动子的作用机制 前言6 3月O 舌6 3 材料与方法6 4 结果6 8 附图7 3 讨 仑8 3 小结8 4 参考文献8 5 综述8 8 致谢j 1 0 1 个人简历1 0 2 中文摘要 K L F 4 在转化生长因子B 1 诱导血管平滑肌细胞 分化中的
4、作用及机制研究 摘要 血管平滑肌细胞( v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l ，V S M C ) 异常增殖是许 多血管增殖性疾病，如动脉粥样硬化、血管再狭窄、高血压等发生发展的 共同病理学基础。既往研究已经证明，转化生长因子p l ( t r a n s f o r m i n g g r o w t hf a c t o r , T G F 1 3 1 ) 作为多肽生长因子家族中的一员，通过与受体 T 1 3 R I T 1 3 R I I ( T G F - pt y p eIr e c e p t o r ，T 1 3 R I ；T
5、G F pt y p eI Ir e c e p t o r ，T 1 3 R I I ) 相互作用而发挥对细胞生长、分化和凋亡的调节作用。阐明T G F D 在 V S M C 生物学行为调节中的作用及其机制，对防治血管重塑和逆转增殖性 血管病变具有重要的意义。 K r O p p e l 样因子( k r f i p p e l 1 i k ef a c t o r ，K L F ) 是一类含有锌指结构的 转录因子，其典型结构特征是在羧基端具有3 个C 2 H 2 锌指结构。K L F 广泛参与细胞增殖、凋亡、分化以及胚胎发育等生命活动的调控。近年来 的研究结果显示，K L F 4 ( k
6、 r n p p e l 1 i k ef a c t o r4 ) 作为转录因子既可直接结 合D N A ，又能通过与其它转录因子相互作用而调控基因的表达。以往研 究证实，T G F 1 31 可诱导K L F 4 表达并促进体外培养的去分化型V S M C 进 行分化，但K L F 4 在T G F D 诱导V S M C 分化中的作用及机制尚不清楚。 为了阐明K L F 4 在T G F p 诱导V S M C 分化中的作用及其分子机制， 本文在系统研究T G F 1 3 1 对V S M C 增殖、分化、迁移、细胞周期等生物学 行为影响的基础上，进一步探讨K L F 4 在T G F
7、1 3 1 促进V S M C 分化中的作 用和分子机制。旨在为揭示动脉粥样硬化、高血压和血管再狭窄等心血管 疾病的发病机制提供新的实验和理论依据，为心血管疾病的防治提供新的 靶点。 1 T G F p 1 诱导V S M C 分化与上调K L F 4 和T I l R I 表达有关 本部分实验以V S M C 分化和去分化标志基因表达水平作为判断 V S M C 表型的指标，检测T G F 1 3 1 对V S M C 表型及相关生物学行为的影 响。为了考察T 1 3 R I 是否参与T G F 1 3 1 诱导V S M C 分化的过程，一方面， 观察敲减T 1 3 1 U 基因表达对V
8、S M C 分化和去分化标志基因表达的影响；另 中文摘要 一方面，观察K L F 4 过表达和敲减对T I B R I 表达以及对V S M C 分化和去分 化标志基因表达的影响。实验结果如下： 1 1T G F B 1 抑制V S M C 增殖、迁移和细胞周期进程 M T T 分析、细胞计数、伤口愈合实验结果显示，T G F p 1 能以浓度 ( O 5 、l 、2 、4n g m 1 ) 和时间( 2 4 、4 8h ) 依赖的方式抑制V S M C 增殖 和迁移，以T G F 1 3 1 浓度为2n g m l 作用于V S M C4 8h 对细胞增殖和迁移 的抑制作用最强。 流式细胞术
9、检测结果显示，T G F 1 3 1 能以时间( 6 、1 2 、2 4 、4 8h ) 依 赖的方式抑制V S M C 细胞周期的进程。T G F 1 3 1 ( 2n g m 1 ) 刺激V S M C 4 8 h 后，停滞于G o G 1 期的细胞数显著增加，同时处于S 期和G 2 h 期的细 胞数明显减少。 1 2T G F 8 1 诱导V S M C 分化标志基因S M 2 2 a 和S MQ a c t i n 表达 S M 2 2 a 和S Ma - a c t i n 表达是V S M C 处于分化状态的重要分子标志， P C N A 表达是V S M C 处于增殖状态的重要标
10、志。采用W e s t e r nb l o t 方法， 检查T G F 1 3 1 对各种标志基因表达的影响。结果显示，在T G F 一1 3 1 处理的 V S M C 中，分化标志基因S M 2 2 c t 和S MQ a e t i n 表达明显升高，而增殖标 志物P C N A 表达显著降低，这些基因的表达变化依赖于T G F D l 作用的时 间和浓度。其中，浓度为2n g m l 和作用时间为4 8h 时变化最为显著。 1 3 敲减T 3 R I 表达对V S M C 分化和去分化标志基因表达的影响 将靶向T I B R I 的小干扰R N A ( s m a l li n t
11、e r f e r i n gR N A ，s i R N A ) 导入 V S M C ，阻断内源性T f l R I 表达后，研究T f I R I 在T G F 3 1 诱导V S M C 分 化中的作用。W e s t e r nb l o t 结果显示，转染T 1 3 R ! s i R N A 可使T f l R Im R N A 和蛋白表达水平降低约7 5 8 0 ，表明该基因的表达被有效敲低。在 T G F B 1 刺激下，转染T f l R I s i R N A 的V S M C 中S M 2 2 a 和S MQ a c t i n 的表 达明显降低，相反，增殖标志物P C
12、 N A 的表达显著增加。 1 4K L F 4 在T G F 8 1 诱导T f l R I 表达及V S M C 分化中的作用 虽然已经发现K L F 4 是参与细胞生长、分化和凋亡的调控，但K L F 4 是否通过T I B R I 介导T G F B 1 的作用目前尚不清楚。 R T - P C R 和W e s t e r nb l o t 结果表明，T G F 1 3 1 显著诱导K L F 4 和T f l R a 基因的转录和蛋白表达，并具有明显的时效( 6 、1 2 、2 4 、4 8h ) 关系。2 n g m lT G F p 1 作用于V S M C6h 后，K L F
13、 4 和T 1 3 R I 的m R N A 和蛋白表达 中文摘要 水平均显著升高，两者的表达变化呈正相关关系。 为了阐明K L F 4 与T D R I 表达之间的关系，将K L F 4 s i R N A 导入 V S M C ，阻断内源性K L F 4 表达后，明确K L F 4 在T G F 1 3 1 诱导T 1 3 R I 及 V S M C 分化标志基因表达中的作用。R T - P C R 和W e s t e r nb l o t 分析结果显 示，转染K L F 4 s i R N A 可敲减K L F 4 表达6 0 以上。在敲低K L F 4 表达的 V S M C 中，T G F 1 3 1 诱导T D R I 表达
