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1、华中科技大学 硕士学位论文 HSV1-tk/FIAU报告基因显像系统在心肌细胞的体外摄取动力学 研究 姓名：尹小花 申请学位级别：硕士 专业：影像医学与核医学 指导教师：张永学 20080501 独创性声明独创性声明 本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文 中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本
2、学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 前前 言言 基因治疗作为一种新型治疗手段具有良好的临床应用前
3、景，已成为近年来的研究 热点之一。 与癌症和单基因失调疾病相比， 心脏疾病的基因治疗还是一个较新的领域， 然而，基因治疗对于多种心血管疾病的治疗均有肯定作用1，已有相关研究进入临床 实验阶段2。基因治疗成功的关键在于能否有效地将目的基因转运到靶细胞并控制该 基因的表达，以避免其在非靶组织中表达。因此，在基因治疗过程中,适时监测外源 基因在体内的定位和表达情况至关重要。对于如何更好地评价心脏疾病基因治疗的疗 效， 目前还没有统一的意见。 临床中主要依赖于病人主观症状的改善和组织取样检测， 动物实验中主要依赖于尸体病理组织学检查。取样后直接测量外源基因表达的方法包 括 PCR、原位杂交、免疫组化等
4、，这些技术虽然可以准确反映靶组织内治疗基因的表 达，但是需要用有创性的方法取材，难以在临床上推广实施。随着心脏疾病基因治疗 的迅速发展，创建一种简单、无创、动态、灵敏的检测方法，用于探测心脏疾病治疗 基因在体内的表达部位和表达水平，从而监测疗效是十分必要的。 报告基因显像是一种体外探测基因表达的分子影像学方法，报告基因与目的基因 相连接后共同导入靶细胞，可表达生成容易被测量的表型如受体或酶，因其表达与目 的基因的表达高度相关，我们可以通过报告蛋白的表达程度来间接判断治疗基因的转 染是否成功及其在体内的分布、持续时间和表达水平。与直接显示治疗基因的反义显 像相比，报告基因显像不需要针对不同的靶分
5、子研制特异性的分子探针，即不同的治 疗基因可通过与同一种报告基因连接，用同一种方式显像，这使报告基因显像在监测 基因治疗方面有着更广泛的应用范围。因此，报告基因技术为基因治疗的监测提供了 一种相对简单、价廉、准确、无创的方法，而且能进行更为精确的定量分析3。 过去常用检测报告基因的方法有： (1)通过组织活检进行免疫组化或组织化学染色 检测报告基因表达的蛋白；(2)用探针与报告基因的mRNA进行杂交；(3)报告基因表达 的蛋白质如能分泌入血，可检测血液中的这种蛋白质水平的变化。这些方法也需采用 侵入性的方法取材，故仅适用于体外实验。活体动物中报告基因显像方法包括放射性 华 中 科 技 大 学
6、硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 核素显像、磁共振显像、生物发光显像和荧光显像等4-6。相比之下，核素报告基因显 像开展较早，是一种具有临床应用潜力的显像技术。通过非侵入性动态监测报告基因 在体内的生物学过程，核素报告基因技术不仅可以提供断层和定量的信息用于评价代 谢、血流灌注等多种指标，还可以进行动物及人类活体的直观显像。核素显像可分为 单光子发射计算机断层(single photon emission computed tomography, SPECT)显像和正 电子发射断层(positron emission tomography, PET)显
7、像，虽然有文献报道应用PET进行 心脏疾病基因治疗报告基因显像7，但PET显像价格昂贵，其显像剂不易得到，相比 而言，应用SPECT进行报告基因心脏显像在国内更具有可行性。 目前用于体内转基因显像的报道基因系统很多，其中单纯疱疹病毒 1 型胸苷激酶 基因(herpes simplex virus type 1 thymidine kinase, HSV1-tk)是一种常用的标示性基因， 在正常宿主细胞中不表达，可编码催化磷酸化的酶，使标示性底物聚集于靶细胞中。 在 各 种 底 物 中 ， 氟 - 碘 阿 糖 呋 喃 基 脲 嘧 啶 (2-fluoro-2-deoxy-5-iodo-1- -D-
8、arabinofuranosyl-uracil, FIAU)对于探测 HSV1-tk 表达具有较高的灵敏度和特异性 8。针对 HSV1-tk/FIAU 报告系统的研究，目前主要集中于肿瘤基因治疗的监测9，而 在心脏疾病基因治疗的监测方面应用较少。 如何能够得到清晰的核素报告基因显像是目前面临的一个难题，将报告基因安 全、高效地导入靶细胞是解决这一问题的关键。常用的携带外源基因载体有病毒载体 系统和非病毒载体系统10，前者主要利用载有外源基因的缺陷病毒感染靶细胞，后者 是借助脂质体、质粒DNA、磷酸钙等携带外源基因进行基因转移。 病毒载体具有转染效率高、容量大、血清滴度高等优点，在基因转导中应用
9、较为 广泛，常用的有逆转录病毒和腺病毒等11,12。逆转录病毒载体的优点是：宿主范围广 泛，感染效率高；可将外源基因以前病毒形式整合入宿主细胞基因组，使之稳定存在 并持久表达，不易对宿主细胞产生毒性或激发免疫反应。其缺点有：不能感染非分裂 期细胞；在血循环中可激活补体系统而被灭活；随机整合插入有诱导异常突变和激活 癌基因的可能。腺病毒载体的主要优点是：感染效率高；能同时感染分裂期和非分裂 期细胞；病毒颗粒稳定，滴度高于逆转录病毒；不整合入染色体；无包膜，不易被补 体灭活。但也存在靶向性欠佳、诱导机体产生免疫反应、对细胞有毒性等不足。由于 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中
10、科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 心肌细胞增殖能力差，用逆转录病毒载体感染效率欠佳13，本课题选用腺病毒作为病 毒载体用于心肌细胞外源基因转导。 非病毒载体中，对脂质体的研究较为深入14。脂质体是一种人工合成的脂质双 分子层封闭膜性微球，结构类似于生物膜，通过与宿主细胞融合、内吞而将基因转入 细胞。依据其所带电荷的不同可分为三类：阳离子、阴离子及中性脂质体，其中最为 常用的是阳离子脂质体，在1987年首先由Felgner PL等报道15，并由Gibco公司首先将 其商品化。阳离子脂质体具有无毒性和免疫原性、有效转染分裂期和非分裂期细胞、 对所包装的外源基因大小和形态没有限制、易于修饰
11、成靶向载体等优势，其主要缺点 是所载基因的表达水平低且表达时间短，不能肯定外源基因的稳定表达16。 本课题构建了携带 HSV1-tk 基因的重组质粒(pDC316-tk)和重组腺病毒(Ad5-tk)， 分别以 Ad5-tk 和脂质体 lipofectamineTM 2000 包裹的 pDC316-tk (pDC316-tk/lipoplex) 为载体转染体外培养的 SD 大鼠乳鼠心肌细胞， 比较转导后心肌细胞对放射性核素 131I 标记的报告探针 FIAU 的摄取情况，通过 RT-PCR、免疫细胞化学及 MTT 对两种载体 进行评价，寻找核素报告基因心脏显像的合适载体，为得到清晰的核素报告基因
12、显像 图像提供理论基础。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4 HSV1-tk/FIAU 报告基因显像系统在心肌细胞的报告基因显像系统在心肌细胞的 体外摄取动力学研究体外摄取动力学研究 摘摘 要要 目的目的 构建携带单纯疱疹病毒 1 型胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重组质粒和重组腺病毒载 体，对比研究重组腺病毒和脂质体包裹的重组质粒体外转导乳鼠心肌细胞后，对核素 标记的报告探针 131I-FIAU 的摄取和基因表达情况，为核素报告基因心脏显像寻找合 适的载体并提供基础。 方法方法 1重组质粒与重组腺病毒的构建及鉴定 以含巨细胞病毒
13、(CMV)启动子的 pDC316 为载体质粒，将报告基因 HSV1-tk 插入 多克隆位点，构建重组质粒 pDC316-tk；以 pDC316-tk 作为重组穿梭质粒，与腺病毒 骨架质粒共转染 293 细胞，包装生成腺病毒重组体 Ad5-tk，本部分与北京本元正阳公 司合作完成。含增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒 Ad5-EGFP 作为对照病毒。 2SD 大鼠乳鼠心肌细胞培养 无菌操作取 13 d 龄 SD 大鼠乳鼠心室组织，剪成 1mm3的组织碎块，采用 0.1% II 型胶原酶单次消化法消化组织块，1 h 差速贴壁法纯化心肌细胞，于 37、5%CO2 环境下培养。生物倒置显微镜下动态观察
14、心肌细胞形态。 3脂质体包裹重组质粒转染体外培养的心肌细胞 心肌细胞贴壁生长达 90%融合时，重组质粒 pDC316-tk 经脂质体 lipofectamineTM 2000 包裹(pDC316-tk/lipoplex)后加入培养孔内，37、5%CO2恒温培养箱中孵育 4h 后将转染液替换为含血清培养基，继续培养至 24h。 4重组腺病毒感染体外培养的心肌细胞 心肌细胞贴壁生长达 90%融合时，计数培养孔内心肌细胞数目，以感染复数 (MOI)20、40、80 计算所需病毒体积，opti-MEM 稀释后加入培养孔中，37、5%CO2 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技
15、 大 学 硕 士 学 位 论 文 5 恒温培养箱中孵育 4h 后换成含血清培养基，继续培养至 24h。 5FAU 的碘化标记 采用 Iodogen 固相氧化法对 FAU 进行放射性碘标记，标记产物用 Sep-Pak C-18 反相色谱层析柱进行纯化和标记率分析， TLC-SG 硅胶板薄层层析法测定 131I-FIAU 的 放射化学纯度和体外稳定性。 6Ad5-tk 和 pDC316-tk/lipoplex 转导心肌细胞后体外摄取及基因表达的比较 心肌细胞转导 Ad5-tk 和 pDC316-tk/lipoplex 后 37孵育 24h，进行 131I-FIAU 的 摄取实验，比较两种载体介导细
16、胞转导后对报告探针的摄取效率；应用半定量逆转录 -聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学方法，分别在 mRNA 和蛋白质水平检测不同 载体转导后心肌细胞内 HSV1-tk 的表达情况；用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法评价转 导后心肌细胞活力。 结果结果 1. 与本元正阳公司协作构建的重组质粒pDC316-tk经PCR、酶切鉴定和测序鉴定 证明序列正确，包装生成的重组腺病毒Ad5-tk的物理滴度(v.p./ml)为1.11012，感染滴 度(TCID50/ml)达1.61010。 2. 0.1% II 型胶原酶单次消化法获得的心肌细胞活力强，培养 24h 后，倒置显微 镜下见心肌细胞相互交联，部分心肌细胞
