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1、第二军医大学 博士学位论文 Eotaxin在皮肤过敏性疾病中的表达调控及苦参方提取物与 eotaxin siRNA的经皮治疗研究 姓名：彭程 申请学位级别：博士 专业：药理学 指导教师：胡晋红 20100501 E o t a x i n 在皮肤过敏性疾病中的表达调控及苦参方提取物和e o t a x i ns i R N A 的经皮治疗研究 摘要 皮肤过敏性疾病是高发的变态反应型疾病，是当皮肤暴露于外界过敏原时，由 全身免疫系统参与而症状产生于局部的病理过程。除了在普通人群中常见外，对于 在边防、海岛等恶劣环境下进行工作与生活的部队官兵，特别如遇战事、灾害等严 峻情况，影响尤为严重。因此，深
2、入探讨皮肤变态反应性疾病的病理过程与机制， 发现新的药物作用靶点和新的治疗药物，具有重要的科学价值与军事意义。 变态反应型疾病发病的确切机制目前仍不十分清楚，但炎症细胞的募集是最终 导致过敏性炎症发生和发展原因。嗜酸粒细胞( e o s i n o p h i l s ，E o s ) 是过敏性疾病中 重要的效应细胞，其浸润于过敏部位，释放毒性蛋白，造成组织损伤，导致炎症发 生。造成E o s 局部浸润的最重要的趋化凶子是嗜酸粒细胞趋化凶子( e o t a x i n C C L I1 ) ， 因此e o t a x i n 的表达与调控是过敏性疾病的重要环节和药物治疗靶点。 E o t a
3、 x i n 参与了皮肤过敏性疾病( 如特异性皮炎、接触性皮炎、药物过敏性皮肤 疾病等) 的进程已得到证实。而人体皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成，e o t a x i n 在 过敏皮肤中的确切表达部位及表达的动态过程目前还没有证实。本研究中，我们以 小鼠接触性皮炎( A C D ) 模型为基础，探讨了e o t a x i n 在过敏环境下皮肤巾的表达 部位及动态特征。同时对皮肤过敏反应的免疫学特征进行了观察，我们对C D 4 + 和 C D S + T 淋巴细胞的浸润的程度和时程进行了比较。此外，为了阐明e o t a x i n 表达的 调控机制，我们以构成表皮层的角质形成细胞( K C
4、 ) 株H a C a T 细胞和构成真皮层 的真皮成纤维细胞( F B s ) 为基础，使用T N F a 和I L 4 刺激两种细胞，观察e o t a x i n 分泌量的改变，并检测与两种因子相关的转录因子N F K B 和S T A T 6 的激活情况， 探讨e o t a x i n 表达的转录机制。 皮肤过敏性疾病的治疗是本课题关注的重要内容。相对于化学药物治疗，传统 药物更显示出开发成本低、疗效好、副作用少、重视免疫平衡等优点。苦参方为一 治疗过敏性皮肤病的传统中医药方剂，其提取物的主要成份为苦参碱( M a t ) 、氧化 苦参碱( O m t ) 、槐果碱( S o p )
5、 、氧化槐果碱( O s p ) 以及荆芥挥发油( S V O ) 。我 们考察了苦参方提取物( K S ) 凝胶剂对小鼠接触性皮炎的治疗效果，同时检测其对 e o t a x i n 的抑制作用，并于细胞水平对其提取物抑制T N F Q 和1 L 4 诱导的e o t a x i n 表 达的信号转导机制进行进一步阐述。 基因治疗是目前疾病治疗的一个研究热点，我们尝试性地对皮肤过敏性疾病的 经皮基凶治疗进行了探索。微乳是经皮给药的一个良好剂型，将经稳定性修饰的 e o t a x i n 特异性s i R N A 制成W O 型微乳剂型，经皮给药，观察其对小鼠接触性皮炎 治疗效果及对e o
6、t a x i n 的在皮肤组织中表达的抑制作用。 第二军医大学博士学位论丈 第一部分：E o t a x i n 在皮肤过敏性疾病中的表达调控 ( 一) E o t a x i n 在小鼠接触性皮炎( A C D ) 中的表达规律研究 1 小鼠接触性皮炎模型的建立：以B A L B c 小鼠为模型动物，用D N F B 涂抹 鼠耳，于第l 、2 天致敏和强化致敏，第5 天激发，可造成鼠耳皮肤过敏反应；小 鼠耳肿胀度呈现一动态过程，肿胀高峰出现在2 4h - 4 8h ，肿胀度可达0 2 6 4 - 0 0 4 m m ，炎症待续5 天左右，皮肤组织病理榆测结果、血液炎症细胞计数证实了这一 结
7、论。其中E o s 计数检测中，激发前小鼠血E o s 为0 1 9 3 ：0 0 4 2 x1 0 一L ，激发后于lh 2h 开始升高( 1 9 4 4 - 0 1 2 x 1 0 7 L ) ，至2 4h 达到最高( 6 6 3 4 - 1 1 2 1 0 T L ) ，7 2h 开始 减弱至5d 恢复正常。此外，采用流式细胞术检测血中C D 4 + 和C D 8 + T 细胞数量比， 免疫组织化学方法检测组织中C D 4 + T 细胞和C D 8 + T 细胞的量，发现在过敏进程中， 血液和组织中的C D 4 + 和C D 8 + T 细胞数量都有不同幅度的增长。 2 采用原位杂交实验
8、技术检N d , 鼠过敏皮肤中e o t a x i nm R N A 表达情况，观察 到其主要产生于真皮层，少量产生于表皮层，同时血管内皮和软骨组织也有表达， 由此证明真皮成纤维细胞是e o t a x i n 在过敏状态下的主要来源。 3 分别采用r e a l t i m eP C R 、免疫组织化学和w e s t e r n b l o t t i n g 检测法检测e o t a x i n 在组织中表达的动态规律，及用E L I S A 检测血清中e o t a x i n 的浓度。发现激发后2h 在组织中已经开始有e o t a x i n 的表达，到6h 1 2h 表达量到最
9、大并持续到2 4h ，之 后有所下降，到7 2h ，基本恢复到最初状态。 ( 二) E o t a x i n 在皮肤细胞中产生的调控机制研究 1 采用不同浓度的T N F - a ( 1n g m L 、1 0n g m L 、1 0 0n g m L ) 和I L 一4 ( 2n g m L 、 1 0n g m L 、5 0n g m L ) 分别与H a C a T 细胞株和真皮成纤维细胞( F B s ) 共同孵育1 2 h ，用r e a l t i m eP C R 和E L I S A 方法检测e o t a x i nm R N A 和蛋白表达的情况，发现T N F i f
10、, 和I L 4 均能上调e o t a x i n 的表达，并呈剂量依赖性。而且无论是基础表达还是在两 种细胞因子刺激下，F B s 分泌e o t a x i n 的能力远远高于H a C a T 细胞。当同时使用 T N F a1 0 0n g m L 和l L - 4i 0r i g m E 时，发现T N F a 和I L _ 4 对两种细胞中e o t a x i n m R N A 和蛋白的上调均有协同作用。 2 分别或同时用1 0 0n g m LT N F 吨和1 0r i g m EI L - 4 与两种细胞共同孵育， 用r e a l t i m eP C R 和流式细胞
11、术观察e o t a x i nm R N A 和蛋白在7 2h 内动态表达的动 力学过程，发现F B s 比H a C a T 细胞较早地表达e o t a x i n ，也较快达到高峰，同时衰 减也较快，而H a C a T 细胞表达e o t a x i n 则较为缓慢和平稳，可持续较长时间。 3 通过E M S A 和w e s t e r n b l o t t i n g 分别检测转录因予N F r B 核转位和S T A T 6 磷酸化的情况。在两种皮肤细胞中，T N F n 和l L - 4 可以分别激活N F K B 和S T A T 6 发牛核转位，而N F r B 特异性
12、拮抗剂P D T C 和转录因子S T A T 6 特异的s i R N A 可 2 E o t a x i n 在皮肤过敏性疾病中的表达调控及苦参方提取物和e o t a x i ns i R N A 的经皮治疗研究 以抑制T N F O r 和I L 4 引起的e o t a x i n 上调，从而证实两种细胞受T N F a 和I L _ 4 刺 激后，均可通过N F r , B 和S T A T 6 转录导致e o t a x i n 的表达。 本部分研究证实了e o t a x i n 在小鼠接触性皮炎模型皮肤组织中表达有明显上调， 并确定了表达的具体部位及动态过程。同时在离体细胞的
13、研究中也证实和在体情况 相似的表达特征，真皮成纤维细胞表达e o t a x i n 的能力要高于表皮角质形成细胞。 并且T N F O r 和I L 4 可以通过N F K ：B 和S 仉盯6 调节e o t a x i n 的表达。 第二部分：苦参方提取物小鼠接触性皮炎的治疗作用及对e o t a x i n 抑制作用研究 ( 一) 苦参方提取物( K s ) 治疗小鼠A C D 的疗效及机制研究 1 苦参方治疗小鼠A C D 疗效观察：采用检测小鼠耳厚度的方法观察药物治疗 效果。致敏前耳厚度：0 3 7 + 0 0 3m m ：致敏2 4h ：0 6 6 , a = 0 0 5m m ；
14、1 苦参方凝胶干 预组：0 4 7 士- 0 0 4m m ：5 苦参方凝胶干预组：0 4 9 - a = 0 0 6m m ；西替利嗪干预组： 0 5 0 士0 0 4m m ；地塞米松干预组：0 4 1 士0 0 4m m 。证实苦参方凝胶组可以显著改善 小鼠耳肿胀度( 尸 0 0 1 ) 。同时通过H E 染色的病理切片观察，也充分证明了药物 对炎症细胞浸润的改善作用。 2 采用流式细胞术和免疫组化分别对血液和组织中C D 4 + 和C D S + 的T 淋巴细 胞进行了检测，考察苦参方对机体免疫状态的调节作用。证明苦参方可以调节机体 的免疫状态，可降低C D 4 + 和C D 8 +
15、T 细胞的组织浸润和在血液中的募集。 3 小鼠全血E o s 计数榆测。苦参方凝胶组可以显著降低过敏导致的小鼠E o s 升高( 尸 0 0 1 ) ，小鼠致敏前E o s 计数：0 1 9 士O 0 4 x 1 07 L ：致敏2 4h ：6 6 3 士1 1 2 x 1 07 L ； 1 苦参方凝胶干预组：4 7 8 - - 1 = 0 6 6 x1 07 ，L ；5 苦参方凝胶干预组：2 2 4 士0 5 8 x1 0 7 L ； 西替利嗪组：5 2 2 士0 7 3 x1 0 L ；地塞米松组：0 9 6 士0 2 2 x1 07 L 。 4 R e a l 4 i m eP C R
16、、w e s t e r n b l o t t i n g 、免疫组化法检测e o t a x i n 组织表达情况。 结果表明苦参方凝胶剂可抑制e o t a x i n 的表达，证明e o t a x i n 可能为苦参方的作用靶 点之一。 ( 二) K S 抑制皮肤细胞中e o t a x i n 表达机制研究 1 M T T 法检测苦参提取物( K S ) 、荆芥挥发油( S V O ) 、M a t 、O m t 、S o p 、O s p 、 盐酸西替利嗪( C e t ) 、地塞米松磷酸钠( D e x ) 对H a C a T 细胞和F B s 生存率的影响， 证明K S 和S V O , L ：_ 5 0 0I _ t g m L ，M a t 、O m t 、S o p 、O s ；p 1 0 0 0l x M 、C e t 2
