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1、大连医科大学 硕士学位论文 用PCR法快速定量人类粪便中双歧杆菌的研究 姓名：于静 申请学位级别：硕士 专业：病原生物学 指导教师：唐立 20040601 用P C R 法快速定量人类粪便中双歧杆菌的研究 硕士研究生：于静 指导教师：唐立教授 专业名称：病原生物学 摘要 目的：人类肠道拥有大量活跃、复杂的菌群，其中约占正常成人 肠道菌群3 ，婴儿肠道菌群7 5 9 1 的双歧杆菌是一种重要的维持肠 道微生态平衡的生理菌，具有预防腹泻与肠道感染、缓解便秘、免疫 调节的作用，【“2 】快速准确定量人类粪便中的双歧杆菌对于分析肠道复 杂菌群的结构，配合临床检验指导临床用药，保持肠道菌群动态平衡， 维
2、持健康预防疾病具有重要意义。目前国内外对于肠道中双歧杆菌的 定量采用的对粪便标本进行稀释滴种法分离计数，费时费力；在提取 D N A 基础上建立的普通P C R 法只能定性和半定量，【3 J D N A 提取步骤 繁琐且D N A 提取中用到的酚、蛋白酶K 等试剂易抑制P C R 扩增， 4 】 影响双歧杆菌的定量。本实验的目的是将粪便离心、洗涤处理后，不 经过分离培养和D N A 提取纯化步骤，用r e a l - t i m eP C R 建立快速、准 确从粪便标本中定量双歧杆菌。 方法：实验分为二部分：第一部分用普通P C R 法定量人类粪便中 双歧杆菌。根据1 6 S r R N A
3、基因设计双歧杆菌属特异引物，将粪便离心、 洗涤处理后，不经过分离培养和D N A 提取纯化步骤，用普通P C R 法 从粪便标本中半定量双歧杆菌。并且比较普通P C R 定量的双歧杆菌结 果和传统稀释滴种法定量的双歧杆菌结果的相关性。第二部分用 r e a l t i m eP C R 法定量人类粪便中双歧杆菌。利用相同的双歧杆菌属特 异引物，将粪便离心、洗涤处理后，不经过分离培养和D N A 提取纯化 步骤，但经过系列稀释粪便后用r e a l t i m eP C R 定量双歧杆菌。并且比 较r e a l t i m eP C R 定量的双歧杆菌结果和传统稀释滴种法定量的双歧 T 。 杆
4、菌结果及普通P C R 定量的双歧杆菌结果的相关性。实验采用健康成 人粪便标本2 0 例，便秘及腹泻粪便标本l O 例。 结果：l 、粪便标本前处理采取简单的离心和清洗、稀释步骤去除 粪便标本中的抑制物，加入2 T r i t o n X 。1 0 0 释放D N A 模板。2 、粪便 标本普通P C R 得理论菌数与培养得菌数值之间无显著差异( P O 0 5 ) ； 粪便标本普通P C R 得灰度值与培养得菌数值之间明显相关( P 0 0 5 ) ：粪便标本r e a l t i m eP C R 得理论菌数与普通P C R 得灰度值 之间明显相关( P O 0 5 ) ；t h e r
5、ei so b v i o u sc o r r e l a t i o nb e t w e e nn o r m a l P C R q u a n t i f i c a t i o ni nf e c e sa n dc u l t u r e db a c t e r i aq u a n t i f i c a t i o n ( P O 0 5 ) ( 3 ) T h e r ei sn oo b v i o u sd i f f e r e n c eb e t w e e nr e a l t i m eP C Rq u a n t i f i c a t i o n a n
6、 dc u l t u r e db a c t e r i a ( P O 0 5 ) ；t h e r e i so b v i o u sc o r r e l a t i o nb e t w e e n r e a l t i m eP C R q u a n t i f i c a t i o na n d n o r m a lP C R ( P O 0 5 ) C o n c l u s i o n s ：N o r m a lP C RC a ns e m i q u a n t i f yb i f i d o b a c t e r i ai nh u m a n f e
7、 c e sq u i c k l y , a n dr e a l - t i m eP C Rc a nq u a n t i f yb i f i d o b a c t e r i ai nh u m a n f e c e sa c c u r a t e l ya n dq u i c k l y K e yw o r d s ：Q u a n t i f i c a t i o n r e a l t i m eP C R b i f i d o b a c t e r i an o r m a lP C R f e c e s 4 用P C R 法快速定量人类粪便中双歧杆菌的研
8、究 硕士研究生：于静 指导教师：唐立教授 专业名称：病原生物学 刖菁 人类肠道拥有大量活跃、复杂的菌群，正常条件下，肠道菌群在 消化食物、代谓 内源外源复合物、产生维生素、防止致病菌在肠道定 檀等方面起重要作用。【5 。6 】近年来，通过对肠道微生态系的研究，人们 已经认识到约占正常成人肠道菌群3 ，婴儿肠道菌群7 5 - 9 1 的双歧 杆菌是一种重要的维持肠道微生态平衡的生理菌，具有预防腹泻与肠 道感染：缓解便秘、免疫调节的作用。双歧杆菌作为肠道主导菌，对 其快速准确定量对于分析肠道复杂菌群的结构，配合临床检验指导临 床用药，保持肠道菌群动态平衡，维持健康预防疾病具有重要意义。 因此建立一
9、种从人类肠道复杂微生物群中快速准确定量双歧杆菌的稳 定方法是有必要的。 目前国内外对于肠道中双歧杆菌的定量仍旧主要采用对粪便标本 进行活菌计数法。这种传统的以细菌分离、培养为基础的微生态学研 究方法能够计数标本中的活菌数，但标本必须经过分离培养，双歧杆 菌对营养的要求高，有的双歧杆菌不能被培养。【7 】并且稀释平皿接种费 时费力需要有专业经验的人员操作，如果微生物分布不均，呈链状或 成丛，会导致低估双歧杆菌数量。【8 】所以活菌计数法精确度不高，耗时、 费力，不能快速检测菌群，从而不能有效指导临床用药。近年来，在 提取D N A 基础上建立了普通P C R 法及杂交法检测人肠道菌群，此法 相对
10、活菌计数法简便特异性强，但只能快速定性和半定量，且D N A 提 取步骤依然较繁琐且D N A 提取中用到的酚、蛋白酶K 等试剂抑制P C R 扩增，影响双歧杆菌的定量。现今国内外已有用r e a l t i m eP C R 法对于 双歧杆菌纯培养物进行定量， 9 1r e a l t i m eP C R 法较前两种方法快速、 准确，但对于粪便标本中的双歧杆菌的定量未有报道。 至今对于粪便标本中的双歧杆菌定量的方法存在许多问题，其中 之一是粪便标本的前处理问题。粪便标本中含有多种细菌，若想定量 特定细菌，须解决或有效分离培养或D N A 提取烦琐标本处理问题。为 了进一步简化定量肠道菌群的
11、方法，本实验根据1 6 S r R N A 基因设计双 歧杆菌属特异引物，寻找粪便处理方法。不经过分离培养和D N A 提取 步骤，直接破碎样本中的菌体细胞释放D N A ，用r e a l - t i m eP C R 建立 快速、准确从粪便标本中定量双歧杆菌方法。达到粪便标本经简单处 理，快速r e a l t i m eP C R 法( 约4 小时) 定量其中的双歧杆菌。并且检 验r e a l t i m eP C R 定量的双歧杆菌结果和传统稀释滴种法定量的双歧杆 菌结果的相关性。 材料 1 主要仪器： 仪器名称生产公司 恒温箱北京医疗器械公司 显微镜日本O l y m p u s
12、台式高速离心机北京医疗器械公司 振荡混匀器北京医疗器械公司 D Y Y - I I I 型电泳仪北京六一仪器 多功能紫外透射仪上海Z F - 5 0 1 凝胶成像U，P P C R 仪 香港T h e r m o h y b a i d 荧光定量P C R 仪7 0 0 0 A B I 普通冰箱德国西门子 微量加样器法国G i l s o n 2 主要试剂： ( 1 ) 双歧杆菌菌株 长型双歧杆菌6 1 株，大连医科大学微生态教研室保存。 ( 2 ) 细菌培养及标本处理试剂： 试剂名称 生产公司 胰蛋白胨( t r y p t o n e ) 葡萄糖 琼脂 酵母浸膏 新霉素 丙酸钠 巴龙霉素
13、T r i t o n X 10 0 ( 3 ) P C R 试剂： 试剂名称 T a q D N A P o l y m o r a s e d N T P s 引物名称 大连宝生物公司 国产分析纯 国产分析纯 国产分析纯 国产分析纯 国产分析纯 国产分析纯 北京华美生物工程公司 生产公司 T ，愿挑 ，I t a K a R a 引物序列 g - B i f i d F5 - C T C C T G G A A A C G G G T G G 3 g - B i f i d R- 5 - G G T G T r C T r C C C G A T A T C T A C A - 3 ( 4
14、 ) 电泳试剂： 试剂名称 琼脂糖 T r i s 碱 硼酸 M a r k e r 生产公司 华美生物工程公司 G i b C O B R L 北京化学试剂公司 大连宝生物公司 ( 5 ) 荧光定量P C R 试剂： 试剂名称 生产公司 T a q R - P C R P o l y m o r a s e T a K a R a d N T P sT a K a R a R P C R B u f f e r ( M 9 2 + F r e e ) T a K a R a S Y B RG r e e nI 上海开放科技公司 产地 大连 大连 合成公司 大连宝生物 大连宝生物 产地 北京
15、美国 北京 大连 产地 大连 大连 大连 上海 B S A 华美生物工程公司北京 方法 第一部分 用普通P C R 法定量人类粪便中双歧杆菌 1 研究对象 无特殊饮食及近一月内未服用任何药物及未饮用酸乳的成人粪便 标本。 2 标本采集 采集新鲜粪便3 0 例，从粪便中间部采集。 3 双歧杆菌稀释、滴种、分离、培养、计数 双歧杆菌培养基：U o 改良B s 培养基用于双歧杆菌厌氧培养。西红 柿汁2 0 0 毫升，胰蛋白胨1 5 克，酵母浸膏6 克，葡萄糖2 0 克，氯化 钠5 克，吐温8 0l 克，可溶性淀粉0 5 克，琼脂2 0 克，精制水8 0 0 毫升，溶解后，冷至5 0 C ，加B S
16、添加液5 0 毫升，倒平板，P H 6 8 。B s 添加液：丙酸钠3 0 克加9 0 毫升水，充分溶解，然后加新霉素4 0 0 。毫克，巴 龙霉素1 0 0 毫克，氯化锂6 克，最后加精制水1 0 0 毫升，冰箱保存： 将l 克新采集的标本立即加入9 毫升无菌稀释液做连续1 0 倍稀释， 取各稀释梯度被检液涂在改良B s 培养基平皿上，于厌氧罐内培养7 2 小时，计数。 4 双歧杆菌形态学观察 肉眼观察菌落特征，用革兰氏染色法观察细菌形态特征。 5 引物设计 登陆G e n e B a n k ，查双歧杆菌1 6 S r D N A 特异序列，参考国外文献设 计引物g - B i f i d - F5 一C T C C T G G A A A C G G G T G G 一3 7 g - B i f i d - R 5 G G T G T T C T T c c c G A ：I ：A T c T A C A
