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1、烟台大学 硕士学位论文 过氧化物酶和固定化多酚氧化酶的催化特性及其在儿茶素氧化 中的应用 姓名：刘洪云 申请学位级别：硕士 专业：农产品加工及贮藏工程 指导教师：孙承锋;江和源 20100401 I 摘 要 儿茶素氧化聚合物有许多生理药理功能，针对目前对非茶黄素类聚合物研究的 缺乏，本论文探究了过氧化物酶和固定化多酚氧化酶作用于儿茶素主体成分表没食 子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的催化特性，并通过 IPPO、POD、O2、H2O2组合而 成的 8 种酶组合分别氧化 EGCG、EC、EGCG/EC 和 TP98 四种儿茶素进行了最佳酶 组合的筛选，最后以筛选出的最佳酶组合催化氧化 EGCG、EC
2、 和 TP98 三种儿茶素， 对其形成新聚合物的反应条件进行了优化。结果表明： 1 过氧化物酶和固定化多酚氧化酶催化氧化 EGCG均能够生成非茶黄素类的新 聚合物，分别命名为 P1和 P，物质 P 在温度 50 、底物浓度 1.5 %、反应至 10 min 时生成量最大，在上述反应条件下，其反应动力学符合米式方程，测得最大反应速 度 Vmax 值为 0.108 OD/min，米氏常数 Km 值为 2.565 mg/mL。物质 P1在反应条件 pH 3.0、温度 20 、底物浓度 0.5 g/30 mL、H2O2加入量 1 mL 时含量最大。 2在酶组合的筛选实验中，C 组合（POD+H2O2）
3、催化氧化 EGCG后生成非茶 黄素类物质 P2的含量最大，B 组合（IPPO+O2）催化氧化 EC 后生成物质 P3的含量 最大，A 组合酶促氧化 TP98 后生成物质 P4的含量最大。儿茶素 EC 较 EGCG 不稳 定，更易于生成聚合度高的物质。 3对筛选后的酶组合催化氧化三种儿茶素生成新聚合物的反应条件进行了优 选，结果显示，pH 值对 C 组合催化氧化 EGCG形成物质 P2的影响显著(P0.1)，合 适的反应条件是 pH 3.0，底物浓度 0.4 g/15mL，温度 30 ，反应时间 30 min；温度 和底物浓度对 B 组合催化氧化 EC 形成物质 P3的影响显著(P0.05)，
4、比较适宜的反应 条件为温度 30 ，底物浓度 1.0 %，pH 6.0，反应时间 20 min。底物浓度对组合 A 催化氧化 TP98 形成物质 P4的影响显著(P0.05)，适宜本实验的反应条件为：底物浓 度 2.0 %，反应温度 30 ，pH 5.0。 关键词：过氧化物酶，固定化多酚氧化酶，催化特性，儿茶素，酶促氧化 II Abstract The catechin polymers have many physiologiccal and pharmacologic activities, Aming at the limited sdudies on these polymers，Th
5、is paper did some researches on some partial characterization of Peroxidase and Immolized polyphenol oxidase taking epigallocatechin which is the most component in catechins as substrate. And the siftings of eight enzymatic combinations with IPPO, POD, O2 and H2O2 through catalizing four catechin co
6、mbos by above enzymatic combinations. Then, the optimum catalytic reaction conditions of three catechins EGCG，EC and TP98 catalyzed by enzymatic combinations screened out. The main results of every part were as following: 1. Undefined substances P1 and P which do not belong to theaflvains created in
7、 the process of oxidations of epigallocatechin using Peroxidase and Immolized polyphenol oxidase perspectively. And the optimal condition of producting P is that temperature is 50 , concentration of substract is 1.5 %, reaction time is 10 min. The reaction kinetics accords with Michaelis- Menton mod
8、el under the above conditions. The value of Vmax is 0.108 OD/min, and Km is 2.565 mg/mL. The optimal condition of producting P1 is that pH is 3.0, temperature is 20 , concentration of substract is 0.5 g/mL, uptake of H2O2 is 1 mL. 2. The area of new polymer P2 is most when using comboC(POD+H2O2) cat
9、alyzing EGCG; The area of new polymer P3 is largest when using comboB(IPPO+O2) catalyzing EC; And the area of P4 is most when using comboA(IPPO) catalyzing TP98. EGCG is more volatile than EC, and is prone to form high- polymers. 3. The optimization of catalytic reaction conditions of three catechin
10、 combos catalyzed by enzymatic combinations screened out were investigated. Results showed that, pH had significant influence(P0.1) on the catalyzing EGCG by comboC forming P2. The optimum reaction conditions of comboC catalyzes EGCG forming P2 is that pH 3.0, concentration of substrate is 0.4 g/15m
11、L, temperature is 30 , reaction time is 30 min. The temperature and the concentration of substrate significant effected on the catalyzing EC by comboB forming P3(P下部叶11。 自 1883 年 Yoghid 发现日本漆树漆酶， 关于多酚氧化酶的研究便一直处于活跃状 态，1928 年 RaPer 已将这一大类酶分为三种类：酪氨酸酶、儿茶酚酶和漆酶。茶多 酚氧化酶是茶叶自身酶系中的主要酶系，在茶树生命活动和茶叶加工过程中参与 一系列由酶
12、促活动而引起的化学变化，发挥着重要的作用12。在茶叶发酵过程中， PPO 在有氧气存在的条件下，催化各种酚类（单宁、儿茶酸、黄酮、一元酚等）成 醌类，醌类聚合或者与茶叶中的氨基酸结合，进一步氧化形成分子量较大的茶黄素、 茶红素、茶褐素等。 1912 年苏联学者巴哈(Baxa A)提出如下发酵理论:被氧化的物质吸收氧原子而形 成过氧化物，过氧化物酶分解这些过氧化物，而后放出氧原子再氧化其他物质。而 N. Subramanian在 1999 年发现 PPO 在氧化儿茶素时生成 H2O2，过氧化物酶在 H2O2 存在条件下，进一步由过氧化物酶催化氧化茶黄素形成茶红素，这与巴哈的研究结 果一致，他认为
13、，在正常红茶发酵条件下茶黄素转化为茶红素量增多，可能是因为 有效 H2O2增多的缘故13。 酶具有催化效率高、 专一性强的特点， 然而其功能受到各种物理化学因子的影响。 烟 台 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 每一种酶都有其适宜的反应条件，大量学者对植物多酚氧化酶的酶学特性及褐变调 控做了研究，早在 1966 年，Gregory R P F 已从茶中分离出茶多酚氧化酶，并对其性 质进行了研究14 。到现在为止，关于茶多酚氧化酶和过氧化物酶的研究仍未停止。 pH 是描述酶活性特征重要的一部分， 所有的酶对应其活性， 都有一个最适的 pH 值，不同来源不同底物的多酚氧化酶最适 pH 值有所不同
14、。 （作为一段，太短，这样 文章结构显得不紧凑，下同） 研究表明，以邻苯二酚为底物时，茶鲜叶中茶多酚氧化酶 PPO 的最适 pH 为 5.615，茶中的 PPO 以连苯三酚为底物时最适 pH=5.7，愈创木酚时 pH=5.0 14。而王 丽霞等对福建四个主要乌龙品种毛蟹、铁观音、黄旦、肉桂的 PPO 酶活特性进行了 研究，发现适宜 pH 值则偏碱，为 pH=6.816；对福云 6 号茶叶茶多酚氧化酶进行考 察，发现维持较高酶活性的适宜 pH 值也相对偏碱，在 pH 值 8.6 时表现为一个酶活 性高峰，在 pH 值 4.08.6 时多酚氧化酶酶活性都上升，这与前期认为茶叶 PPO 最 适 PH
15、 值处在酸性环境中不同，她认为可能是因为生长条件、水质、采摘季节及土壤 性质不同所致17。对于 PPO 在形成茶黄素的作用上，茶叶粗 PPO 在 pH 4.5 时形成 的茶黄素较多，而纯化的 PPO 则相反，在 pH5.5 时形成的茶黄素较多，而 PPO 和 POD 同时存在时，结果与粗酶一致13。 不同地区不同品种不同季节等的差异，使得多酚氧化酶的适宜 pH 众说纷纭，但 大多数植物和水果的多酚氧化酶最适 pH 接近于中性。 温度是描述酶特征的另一个关键因素， 酶催化反应对温度的依赖性表现出有一个 最优值，最佳温度一般在 30 60 之间。 1966 年，GREGORY R P F 考察发现，以联苯三酚为底物时，茶多酚氧化酶的最 适温度为 30 14； 赵淑娟等以邻苯二酚为底物研究的茶多酚氧化酶的最适温度则为 50 15；王丽霞等发现福建四个主要乌龙品种毛蟹、铁观音、黄旦、肉桂的 PPO 酶 活力在 4565范围内均成型变化趋势，依次在 45 、55
