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1、E f f e c ta n dm e c h a n i s mo fl u t e i no ng a s t r i c c a n c e rS G C 7 9 01c e l l B y B oJ i S u p e r v i s o r ：P r o f L e iF uM i n gc h e nW a n g p n a r m a c o l o g y ， S c h o o lo fP h a r m a c e u t i c a ls c i e n c e M a y , 2 0 1 2 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研
2、 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者：髯镜 日期：为7 2 年 易月 WE l 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位
3、论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者：翼札 日期：钏2 年6 月凇E l 摘要 摘要 背景与目的：胃癌在我国的发病率居全国首位，是一种常见的恶性肿瘤之一。 传统的治疗手段主要有手术治疗、放射治疗、化学治疗以及免疫治疗等，这些 治疗手段虽然在一定程度上延长了胃癌患者的寿命，但是对于胃癌病人的治愈 率仍需进一步提高。叶黄素( L u t e i n ) 是一种天然的含氧类胡萝卜素，主要存在 于蔬菜、水果等膳食中，医学实验证明植物来源的L u t e i n 是一种高性能的抗氧 化剂，
4、在预防黄斑变性、心血管疾病、白内障以及肿瘤的发生发展等方面有着 重要的作用。但利用其抗氧化特性对肿瘤进行进一步的治疗很少见报道。本实 验旨在研究L u t e i n 对活性氧和胃癌S O C 7 9 0 1 细胞凋亡的影响以及进一步探讨 其分子机制。 方法lL u t e i n 对胃癌S G C 7 9 0 1 细胞的增殖抑制效应及其凋亡机制，采用S R B 法绘制S G C 7 9 0 1 细胞8 d 内的生长曲线；S R B 法检测不同浓度L u t e i n 对 S G C - 7 9 0 1 细胞增殖的影响；倒置显微镜下观察S G C 7 9 0 1 细胞经过药物作用后 的形态学
5、变化；H o e c h s t 3 3 3 4 2 P I 荧光染色法观察L u t e i n 对胃癌S G C 7 9 0 1 细胞 的生长抑制作用及诱导凋亡的情况。荧光分析法检测L u t e i n 作用S O C 7 9 0 1 细 胞后，细胞内R O S 的变化：采用G S H 和生色底物D T N B 反应产生黄色的T N B 和G S S G 的颜色反应检测L u t e i n 作用S G - C 7 9 0 1 细胞后细胞内总谷胱甘肽含量 的变化；R T - P C R 法检测细胞内S O D 2 m R N A 、I K B a m R N A 和N F 1 c BP
6、6 5 m R _ N A 的表达情况；W e s t e r n - b l o t 检测细胞内I K B a 、N F r , BP 6 5 以及B c l X 1 蛋白的表 达情况。 结果lS R B 法检测结果显示，L u t e i n 呈时间剂量依赖性的抑制胃癌S G C 7 9 0 1 细胞的增殖，其中4 0 m g L d 的L u t e i n 作用S G C 7 9 0 1 细胞2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 的抑 制率分别是8 5 7 0 硅2 4 3 、2 5 0 7 0 硅2 9 0 和3 2 3 3 0 硅1 8 1 ：1 6 0 m g L q 的L u
7、 t e i n 作用S G - C 7 9 0 1 细胞的抑制率分别上升为3 4 7 2 d ：4 0 6 、6 4 5 5 0 o _ - 1 ：2 4 8 和 8 3 2 9 0 硅0 1 0 。H o e c h s t 3 3 3 4 2 P I 荧光染色法检测细胞的凋亡情况，对照组显示 低蓝光低红光，4 0 m g L q 部分显示高蓝光低红光，8 0 m g L 1 大部分显示高蓝光 低红光，1 6 0m g L 以大部分显示低蓝光高红光；荧光分光光度计检测L u t e i n 作 用胃癌S G - C 7 9 0 1 细胞后细胞内R O S 的变化，结果显示，随着L u t
8、e i n 浓度的升 高，细胞内R O S 的含量显著降低( P 4 0 培养基，放于含5 C 0 2 、3 7 、饱和湿度的 C O z 培养箱中进行常规培养，倒置显微镜下观察细胞成贴壁状态生长。细胞生 长至2 3 d ，用0 2 5 的胰蛋白酶进行一次消化传代，实验安排视细胞的生长状 态而定。通常，实验前1 d 对细胞传代一次，待细胞生长至对数期进行实验。为 了便于保存细胞株，选择生长状态良好的细胞进行冻存，冻存前l d 对细胞进行 换液，保证细胞有足够的营养。将细胞进行消化，离心，用冻存液吹散细胞， 分装于冻存管中，逐步缓慢降温：4 3 h ，2 0 2 h ，8 0 l h ，液氮(
9、- 1 9 6 ) 冻存。 2 2 人胃癌S G C 7 9 0 1 细胞生长曲线的测定 用S R B 法检测S G C 7 9 0 1 细胞8 d 内的生长曲线。取8 0 融合的对数生长 期细胞，倒去培养液，用P B S 冲洗两遍，加0 2 5 的胰蛋白酶进行消化，静置 5 - 6 m i n ，于倒置显微镜下观察。细胞间隙变大且细胞变圆，弃去胰酶，加入2 - 3 m i R P M I I ( 4 0 培养液轻轻吹打细胞至单细胞悬液，对细胞进行计数，以每孔5 0 0 0 个细胞接种于9 6 孔板中，每孔加2 0 0 9 l 培养液，每组设6 个复孔，共接种8 块 板，于3 7 、5 c 0
10、 2 的细胞培养箱中进行孵育。每2 4 h 取一块9 6 孔板，每孔 7 L u t e i n 对胃癌S G C - 7 9 0 1 细胞的作用及分子机制研究 加入5 0 山预冷的5 0 的T C A ( 终浓度为l O ) 进行固定，固定液需要轻轻滴 入培养液表面，并将培养板在超净台上静置1 0 m i n 后平行移至4 C 冰箱，固定 l h 。待细胞固定于培养板底部后，倒掉孔内溶液，用去离子水冲洗，每孔5 遍， 甩干，常温空气干燥。观察培养板完全干燥后，每孔加入已配好的O 4 的S R B 溶液5 0 m ，室温染色1 5 r a i n ，未与蛋白结合的S R B 用1 的醋酸溶液洗
11、5 遍， 空气干燥；与蛋白结合的S R B 用15 0 “l1 0 r e t o o l L 1 的T f i s - b a s e 碱液( P H l O 5 ) 溶解。在全自动酶标仪上5 1 5n i n 波长处测定每孔的O D 值。用S R B 法，连续 检测8 d ，并记录O D 值。以时间为横坐标，O D 值为纵坐标，绘制细胞生长曲 线。 2 3S R B 法检测L u t e i n 对S G C 7 9 0 1 细胞增殖的影响 用S R B 法检测不同浓度的L u t e i n 对S G C 7 9 0 1 细胞生长的影响。取对数生 长期的S G C 7 9 0 1 细胞，
12、用0 2 5 胰蛋白酶消化，用含1 0 血清的R P M l l 6 4 0 培养基吹打成单细胞悬液，以每孔5 0 0 0 个细胞，每孔中加入2 0 0 “1 ，接种于3 块9 6 孔板中，于饱和湿度，3 7 、5 C 0 2 的培养箱中常规孵育。2 4 h 后弃去培 养液，分别在每孔中加入终浓度为1 0m g L 一、2 0m g L 1 、4 0m g L 一、8 0m g L 、 1 6 0m g L d 的L u t e i n 溶液，每组设6 个复孔，同时设D M S O 溶剂对照组，将加 过药物的培养板至于3 7 、5 C 0 2 的培养箱中孵育。分别于2 4 h 、4 8 h 、
13、7 2 h 后 各取出一块板，用预冷的T C A 固定细胞，去离子水洗涤固定液，空气干燥后用 0 4 S R B 溶液进行染色，由于不同浓度药物对细胞的作用不同，染色的深浅也 不相同，分别用l 的醋酸溶液溶解细胞中未与S R B 结合的蛋白，1 0 r e t o o l L 吨 的 I r i s b a s e 碱液( P H l O 5 ) 溶解细胞中与S R B 溶液结合的蛋白。最后于全自动 酶标仪上，波长为5 1 5 n m 处检测其O D 值，加药后孵育4 8 h 、7 2 h 的细胞，依 照作用2 4 h 细胞的实验方法进行检测，并且记录每孔的O D 值。根据公式：G I ( 生
14、 长抑制率) = l 一( 药物组O D 值对照组O D 值) 1 0 0 ，计算各加药组的生长 抑制率，以时间为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制图形。 2 4 倒置显微镜下观察L u t e i n 对细胞形态学的影响 取处于对数期融合状态的细胞，进行消化，吹打成单细胞悬液后并计数， 按每孔5 1 0 4 个细胞接种于6 孔板中。2 4 h 后加药，L u t e i n 的终浓度是2 0n a g L d 和1 6 0n a g L 1 ，同时设置D M S O 为对照组。4 8 h 、7 2 h 后，于倒置显微镜下进行 8 L u t e i n 对胃癌S G C 一7 9 0 1 细胞的作
15、用及分子机制硒究 观察，并拍摄加药组和对照组细胞形态学的变化。 2 5H o e c h s t 3 3 3 4 2 P I 双染色法检测细胞凋亡 H o e c h s t 3 3 3 4 2 P I 双染色法检测细胞存活率的情况，以7 2 h 为主要观察点， 实验重复3 次。 S G C 7 9 0 1 细胞的染色步骤： 1 ) 铺板：用胰蛋白酶消化生长状态良好、处于对数期的S G C 7 9 0 1 细胞，弃去 胰酶，用培养基吹打细胞成单细胞悬液，计数，按细胞密度为5 x 1 0 4 - r a l d 接 种于6 孔板中，每孔先加2 m l 培养基，再加l m l 细胞悬液，于3 7
16、、5 c 0 2 的培养箱中进行孵育。 2 ) 加药：细胞生长2 4 h 后，取出培养板，弃去培养液，以L u t e i n 终浓度为4 0 m g L 、8 0m g L 、1 6 0m g L - 1 加入培养板中，在细胞培养箱中培养7 2 h 。 3 ) 收集细胞：药物作用7 2 h 后，取出培养板，倒去培养基，用P B S 冲洗两遍， 加胰蛋白酶消化后，1 0 0 0 r p m ，5 m i n 离心收集细胞。 4 ) H o e c h s t 3 3 3 4 2 染色：将收集好的细胞大概以1 x 1 0 5 个悬浮于l m l 培养基中， 加1 0 u 1 的H o e c h s t 3 3 3 4 2 染液，混匀，于3 7 培养箱中孵育5 1 5 n 血l ； 5 ) P I
