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1、分类号 l8306 62 华中农业大学硕士学位论文 密级 我国部分地区柑橘衰退病毒基因型研究 S t u d y o ng e n o t y p e so fc i t r u st r i s t e z av i r u sf r o ms o m e c i t r u sc u l t i v a t i o nr e g i o n si nC h i n a 研究生：潘嵩 指导教师：洪霓 教授 指导小组：王国平 教授 徐文兴副教授 丁芳副教授 王利平讲师 专业：植物病理学 研究方向：植物病毒学 申请学位：农学硕士 获得学位时间：2 0 1 0 年6 月2 0 日 华中农业大学植物
2、科学技术学院 二O o 年六月 b暑l04Jf量噩簪“瓦量蕾器参 j f ： 华中农业大学学位论文独创性声明及使用岳掣I I I 1 1 r1 7 1 1 9 l l 1 9 l1 9 lI掣III型 学位论文 是否保密 硷 如需保密，解密时间年 月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并
3、表示了谢意。 研究生签名：潘高 时间：弘D 年石月，日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和 电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学雠文储始冶南导师张溜移 签名日期：2 吖D 年1 6 1 月f 日 签名日期：易f ，0 年莎月纱日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 o r I
4、 我国部分地区柑橘衰退病毒基因型研究 目录 摘要I A b s t r a c t I I I 缩略语表V 1 文献综述1 1 1C T V 的国内外研究进展。1 1 1 1C T V 的寄主范围1 1 1 2C T V 的传播方式1 1 1 3C T V 的基因组分子生物学特性2 1 1 4C T V 的株系分化研究3 1 1 4 1 不同C T V 株系在指示植物上产生的症状差异3 1 1 4 2C T V 不同株系的C P 基因特点4 1 1 4 3C T V 不同株系的基因组分化特点4 1 1 5C T V 的防治研究6 1 1 5 1M S C P 防治6 1 1 5 2 抗C T
5、V 基因工程7 1 2 研究目的与意义一7 2 材料与方法9 2 1 研究材料9 2 1 1 样品来源9 2 1 2 试剂9 2 1 3 引物合成9 2 2 研究方法10 2 2 1R N A 提取1O 2 2 1 1 总R N A 提取1O 2 2 1 2d s R N A 提取l l 2 2 2P C R 扩增12 2 2 2 1R T P C R 1 2 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 2 2 2 2 免疫捕捉R T - P C R 13 2 2 2 3 试管捕捉R T - P C R 。1 3 2 2 - 3C P 基因R F L P 分析。l3 2 2 4P C R 产物
6、回收、转化及测序1 3 2 2 4 1P C R 产物回收1 3 2 2 4 2 载体连接1 4 2 2 4 3 热激转化1 4 2 2 4 4P C R 法筛选阳性克隆1 4 2 2 5 序列分析15 3 结果与分析1 5 3 1 三种方法检测C T V 效果比较。l5 3 2C T V 强毒和弱毒株系的鉴定1 6 3 2 1B i R T P C R 鉴定C T V 强毒和弱毒株系结果1 6 3 2 2C T V C P 基因扩增产物的m n f t R F L P 分析结果1 7 3 3 不同C T V 基因型分析18 3 3 1 多重分子标记分析( M M M ) 1 8 3 3 2V
7、 T K l 7 扩增片段的核苷酸及氨基酸序列分析一2 2 3 3 3C T v $ 4 5 样品的基因型分析3 1 4 总结与讨论3 8 参考文献4 0 附录5 0 致谢5 2 我国部分地区柑橘衰退病毒摹冈型研究 摘要 柑橘衰退病为柑橘上发生危害最严重的病毒病，在世界主要柑橘产区均有发生。 引起该病害的病原柑橘衰退病毒( C i t r u st r i s t e z av i r u s ，C T V ) ，属于线形病毒科 ( C l o s t e r o v i r i d a e ) ，长线形病毒属( C l o s t e r o v i r u s ) 。根据其在寄主植物上所引
8、起的 不同症状，可分为速衰株系、茎陷点株系和弱毒株系。根据C T V 基因组序列特点， 可将其分为T 3 6 ，V T ，T 3 和T 3 0 基因型，其中T 3 0 为弱毒株系，其它为强毒株系。 为明确我国发生的C T V 基因型特点及其混合发生状况，本研究对来自我国部分地区 的C T V 进行了分析，结果如下。 1 比较分析了以总R N A 为模板的常规R T - P C R 、免疫捕捉R T - P C R ( I C I m P C R ) 和试管捕捉R T - P C R ( T C R T - P C R ) 3 种方法进行C T v 检测及株系区分的效果，结 果显示，3 种方法检
9、测C T V 均具较好的检测效果，但采用总R N A 为模板时在进行 常规检测及株系鉴定时，扩增产物的电泳条带均相对更清晰些；其它两种方法的扩 增产物电泳条带虽相对较弱，不适合于用B i R T - P C R 方法进行C T V 株系的鉴定，但 可用于大量样品的C T V 检测。 2 采用B i R T - P C R 技术，对来自不同地区的1 4 1 份柑橘样品进行了C T V 强毒 和弱毒株系的鉴定。结果显示，有1 0 7 份柑橘样品的C T V 检测结果为阳性，带毒率 为7 5 8 ，且所检测到的C T V 均为强毒株系。 3 选取1 0 份柑橘样品，对其C P 进行了扩增及扩增产物的
10、所矿I R F L P 分析， 根据G i l l i n g s ( 1 9 9 3 ) 报道的分类规则，初步确定来自样品$ 4 5 的C T V ( C T V - $ 4 5 ) 为 肺I R F L P 类群V ，L R l 、$ 3 6 、$ 3 7 、$ 3 8 和$ 3 9 存在类群I I I 和V 的C T V 混合感 染，而样品$ 4 6 为我国新鉴定出的类群与类群V 的混合侵染。 4 选取以上8 个C T V 感染的柑橘样品及本研究室前期鉴定获得的2 个C T V 单 一分离物感染的柑橘样品，采用l O 对基因型鉴定引物对其进行基因型分析，结果显 示，除N 2 1 为V T
11、 基因型、N 4 为T 3 0 基因型C T V 单一感染外，5 个样品B 1 5 、B 1 6 、 $ 3 6 、$ 3 9 和L R l 存在基因型为V T 、T 3 6 和T 3 的C T V 混合感染；B X 与$ 4 0 存在4 种基因型V T 、T 3 6 、T 3 和T 3 0 的C T V 混合感染；C T V - S 4 5 可能带有T 3 和T 3 0 基 因型。这些结果表明，C T v 强致病性株系V T 和T 3 型在我国发生普遍。 5 对采用引物V T - K 1 7 扩增产物进行了克隆及序列分析，结果显示，所测定分 离物可较为明显地分为V T 基因型与T 3 0 基
12、因型两大类群。其中来自样品$ 4 5 的2 个分离物C T V - S 4 5 2 和C T V - S 4 5 4 与弱毒株系T 3 0 和T 3 8 5 亲缘关系较近，其扩增 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 片段的核苷酸和氨基酸同源性分别在9 6 6 和9 4 9 。其它分离物与V T 基因型聚为 一类，而在该基因型类群中存在较大的分子变异，这些分离物可进一步分为3 个组 群，不同组群间存在特异性的核苷酸和氨基酸位点差异。 6 对C T V - S 4 5 的C P 、K 1 7 和P o l 基因及5 U T R 作进一步测序和序列分析， 发现其C P 基因编码氨基酸序列与T 3 0 同源性较高
