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1、2 . A. h e m e H, E l I d r i s s i e t a l . V e t e r i n a r y Iv b - b id , g y , 1 9 9 2 , 3 1 . 9 9 一9 9 3 . A ld n a r u i t o I Me d . S c i , B io l , 1 9 6 8 , 2 1 , 3 7 9 一 3 9 1 4 . 中 华 人民 共和国兽 用生物制品 质量 标准, 1 9 9 2 5 . 曹尚泽 兽医 微生物学及免疫学技术 6 . M e t h a R , e t a . l m e r n a t io n a l o
2、u r r a l o f F l o o d Mw m b i o 4y , 1 9 8 9 , 9 . 4 5 一 5 0 7 . I d ri w i A H. p h . D. t h e s is , u n iv e r s i t t , o f Min n e s o t a s t . P a u l . U S A. 1 9 9 1 a 衬、 ， 合C型.产气荚膜梭菌R 毒素的提纯与鉴定 张 存帅 辞民 权 中国兽药监察所 北京 1 0 0 0 8 1 一 以C 型产气英膜梭菌C 5 9 - 2 株肉肝胃 酶消化汤培养物为材料， 经离心， 蔡氏滤器除菌后， 滤液用硫酸胺沉
3、淀浓缩。浓缩物用P B S ( P H 7 . 4 ) 溶解后，经S e p h a d e x C 1 0 0 ( 1 . 0 x 1 0 0 cm)层析柱进行毒素蛋白的初步纯化。 收集蛋白 质部分， 经检 验确 认主 要含有A 素的收 集物再 经S e p h a d e x G 2 0 0 ( 2 . 5 x 1 0 0 c m ) 层析柱进行第二次提 纯。收集蛋白 质部分， 进行包括小白鼠M I D侧定、 小白鼠中和试验、 琼脂扩散试验、S D I, P A C E电泳和We s t - e r b lo l 等生物活性测定， 结果表明提纯的A 毒素不仅具有高特异性的生物活性， 而且纯
4、度较高。 关健词C 型产气英膜梭菌A 毒素提 P u r i f i c a t i o n a n d I d e n t i f i c a t i o n o f 卜t r i d i u n t P e r f r i n g e n e s t y p e CZ A a n g C u a s h u a i , X u e Mi.7- ( 岛之 砚C o n t r o l I n s t i t u t e o f V e t e r i n a r y D r u g , B e ij i n g 1 0 0 0 8 1 ) T h e c u l t u r e s o f
5、p e p s in - d ig e s t ed b e e f a n d liv e r b ro t h o f C lo s tr i d i u m p e r f r i n g e r is t y p e C ( C 5 9 - 2 ) 。u s e d in t h is s t u d y . A f t e r t h e c e l ls h a d b e e n r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t io n a n d f il t r a t io n t h ro u g h S e i t z f it t 二
6、， t h e c o ll e c t io n w a s c o n c e r t - t re t e d b y p r e ci p ita t io n w i t h a m m o n i u m s u l f a te . I h e c o n c e n t r a t e d to x in w a s p u r if ie d fi r s t t h ro u g h S e p h a d e x G 1 0 0 c o lu m n ( 1 . 0 x 1 0 0 c r a ) . T h e p ro t ie n c o l l e c t io
7、n s m a i n l y C o n ta i n in g A t o x in id e n t if ie d b y t e s t s w a s p u r if ie d a g a in t h ro u g h S e p h a d e x G 2 0 0 c ol u m n ( 2 . 5 x 1 0 0 c m ) . T h e p ro t e in co lle c t io n s v i m a s s a y ed b y d e t e c t io n o f le t h a l a c t iv i t y , n e u tr a liza
8、 - t io n t e s t , A g e r d if f u s io n t e s t , S D S P A G E a n d We s t e r b lo t . T h e r e s u l t s s h o w e d t h a c t h e p u r if ie d t o x i n w a s h i g h ly p u r i - fi e d (3 t o x in w it h s p e c i f i c b i o lo g i a l a c t iv i t y . K e y w o r d s C lo s t r i d iu
9、 m p e r f r i n g e n s t y p e C (3 t o x i n p u r if ic a t io n a n d I d e n t ifi c a t io n C型产气英膜梭菌是引起羊碎死、羔羊、 犊牛和仔猪痢疾的主要病原。C 型产英膜梭菌主要 产 生。 和日 毒 素， 引 起 高 度 致 死 性 坏 死 性 肠 炎 ( t ) 。自 从O a k le y 于1 9 4 3 年 对 其 产 毒 情 况 首 次 报 道 以 来( 2 ) ， 该毒 素的 致病机 理已被人们 所认识， 并在疾病的防预方面也取得了巨大成就。 但在疾 病的诊断和病原的定型方面仍
10、停留 在细菌分离与血清中和试验的 方法上， 需时长， 方法繁琐。 探 索简 便易行的 诊断方 法， 是当今 控制 该病首要解决的 问 题之 一。 为此我们进行了日 毒素的提 纯与 鉴定。为建立新的免疫诊断方法提供材料和依据。 材料与方法 材料: 1 . 菌种: A型产气荚膜梭菌C 5 7 - 1 、 C 5 7 - 2 菌株; B型产气英膜梭菌C 5 8 - 1 , C 5 8 - 2 菌株; C 型产气英膜梭菌C 5 9 - 1 , C 5 9 - 2 菌株; D M产气英膜梭菌C 6 0 - 1 , C 6 0 - 2 菌株;由中 监所菌种保藏 中心提供。 一1 0 0 一 2 . 定型血
11、清: 产气英膜梭菌A , B , C , D型血清， 购于新疆生物药厂， 为特异性羊血清。 3 . 小白鼠: 1 8 - 2 0 8 健康小白 鼠， 由 中 监 所健 康动物室提 供。 4 . 化学试剂:试验用化学试剂均为分析纯。 5 . 仪器设备: 电 泳仪、 玻璃柱等。 方法: 1 含毒除菌液的制备和最小致死量的测定 1 . 1 含毒除菌液的制备: 取产气荚膜梭菌冻干菌 株C 5 7 - 1 、 C 5 7 - 2 各1 支， 分别用无菌生理 盐水作1 0 倍稀释后接种厌气肉 肝汤3 7 培养2 4 小时; 取产气荚膜梭菌C 5 8 - 1 , C 5 8 - 2 , C 5 9 - 1
12、, C 5 9 - 2 冻干菌株各1 支， 分别用无菌生理盐水作1 0 倍稀释后接种肉肝胃 酶消化汤3 5 1C培养2 0 小 时; 取产气英膜梭菌C 6 0 - 1 , 0 6 0 - 2 冻干菌株各1 支， 分别用无菌生理盐水作1 0 倍稀释后， 接种 肉 肝胃 酶消化汤， 3 5 培养2 4 小时， 待培养结束后， 分别吸取上清液于无菌离心管中， 3 0 0 0 转 / 分 条件下， 4 C 离心3 0 分钟， 吸取上清液用蔡氏滤器过滤除菌， 滤液收集于干净的无菌容器中， 一 4 0 保存， 作为含毒除菌液备用。 1 . 2 含毒除菌液最小致死量 ( ML D )的 测定: 将各含毒除菌
13、液用无菌生理盐水分别作 1 : 1 0 , 1 : 1 0 0 , 1 : 2 0 0 , 1 : 4 0 0 , 1 : 8 0 0 , 1 : 1 6 0 0 稀释后， 尾静脉接种1 8 - - 2 0 8 小白鼠， 每一稀 释度接种5 只， 每只接种O . l m l ， 接种后观察2 4 小时， 记录小鼠的存活和死亡情况， 并计算含 毒菌液的最小致死量。 Z C 型 产气英膜 梭菌R 毒素 提纯 2 . 1 C 型产 气荚膜梭菌p 毒素的 初提与鉴定: 取制备好的C 5 9 - 2 含毒菌液， 在磁力搅拌下 加人等量的中性饱和 硫酸胺溶液， 混匀后4 C 静置3 0 分钟，以4 0 0
14、 0 转份 离心1 5 分钟， 弃去上 清液， 用原体积l / 2 的灭菌P B S ( p F 1 7 , 7 ) , 溶解后， 装人透析袋中4 透析过夜， 经S e p h a d e x G 1 0 0 ( 1 . 0 x 1 0 0 c m ) 层析往， 以P B S ( p H 7 . 2 ) 为洗脱液4 条件下进行毒素的初步纯化。 用 2 0 % 磺基水杨酸检查洗脱液， 等发现洗脱液中有蛋白 质沉淀时， 开始收集， 直到洗脱液中 无蛋白 质存在时为止。每5 m 洗脱液收集一管， 并进行编号。结束后取收 集液 采用常规 紫外分光光度法 进 行蛋白 质含量测定， 按M u r a t
15、a 等描 述的 方法进行川卵黄沉 淀试验， 以 确定收集液中的 蛋白 质 含量和。 毒素的存在情况。 剩余的收集液一 4 0 保存备 用。 2 . 2 C 型 产气英膜梭菌p 毒素的 进一 步纯化和初步鉴定: 将卵黄沉淀呈可疑反 应蛋白 质含 量较高的毒素初提物合并， 用P E G浓缩至原体积的1 /3。于4 Y ; 条件下以P B S ( p H 7 . 2 )为洗脱 液 在S e p h a d e x G 2 0 0 ( 2 . 5 x I 0 0 e t n ) 柱 中 进 行 毒 素 蛋 白 的 进 一 步 纯 化 (4 ) 。 用2 0 % 磺 基 水 杨 酸 检 查 洗脱液， 待
16、出现蛋白 质沉淀时， 开始收集洗脱液， 直至洗脱液中无蛋白 质时为止， 每5 m 1 洗脱液 收 集一管， 取样 用紫外分光 光度法进行蛋白 质含量测定， 同时 按文 献( 3 ) 提供的 方法进行琼脂扩 散试验，以确定收集蛋白 质中的毒素种类， 记录 测定结果。 3 C 型 产气英膜梭菌p 毒素 提纯物的 鉴定 将蛋白 质含量 高、 琼 扩试 验证明 含有日 毒素的 收 集液合并， 用P E G 浓缩 至原体积的1 / 3 ， 取 样进行如下鉴定试验， 其余一 4 0 保存。 3 . 1 对 小白鼠M L D的 测定: 用 无菌 生 理盐 水 将提纯的p 毒素 作I : 1 0 0 , 1 : 2 0 0 , 1 : 4 0 0, 1 : 8 0 0 , 1 : 1 6 0 。 和1 : 3 2 0 0 稀释后， 分别尾静脉注射 1 8 - 2 飞小白鼠， 每一稀释度接种5 只， 每只0 . l m l 连同对照， 观察2 4 小时， 记录小白鼠的存活死
