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1、河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表 。 与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试 验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则，承担相应的法律责任。 ， 胍! j jj ， 研究生签名：j 、法勒签章：珠二级等蘸警? 粤 、 w 年朔沙日 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注等内容
2、外，文中不包含其他人已发表或撰写的研究 成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究生签名：t i 专 导师签章： 即，年f 月如日 目录 删蚪掣掣必Y 19 0 17 7 5 中文摘要0 1 英文摘要0 6 研究论文C a s p a s e - 3 抑制剂早期干预对小鼠脓毒症相关急性肾损伤的保 护作用 前言0 00000 “一“一“”一1 2 一 日l J 舌“”“一”一”“一”“”一一“”一”“”一”l 材料与方法1 3 结果”- “2 0 附图一“一“2 5 附表”一”一”“”一”一“一”“一”一一一“3 5 讨论”“一“一”一“”“”一一“一“”“”一一“3
3、8 结论一“O OOD00OOOOOO OOO “一”一“一一”一“”OOOOOOOOO O OOOOOO00 一4 4 参考文献O Oo oooOOOOOO 4 4 综述脓毒症急性肾损伤发病机制的研究进展5 0 致谢”一”一一“”“”“”“一“”一一”“一“”“6 4 个人简历6 5 中文摘要 C a s p a s e - 3 抑制剂早期干预对小鼠脓毒症相关 急性肾损伤的保护作用 摘要 目的：急性肾损伤( A c u t eK i d n e yI n j u r y , A K I ) 是危重患者常见的临床并 发症之一，其危害大，病死率高( 5 0 0 0 - - , 7 0 ) ，可作
4、为一项独立危险因素影 响患者预后。A K I 的病因是多因素的，但由脓毒症( s e p s i s ) 弓l 起者可占5 0 以上。有研究表明脓毒症相关急性肾损伤的院内病死率可高达7 0 2 。回 顾过去2 0 年，尽管在治疗和研究技术方面取得了许多进步，但是对于脓 毒症相关A 患者的预后没有实质性改变，其病死率仍在不断增长! 原 因可能与我们对脓毒症相关急性肾损伤的发病机制了解不够，同时缺乏早 期直观的生物学标志物及有效的治疗措施相关。因此探讨脓毒症性肾损伤 的病理生理学机制己成为一热门话题。 近年来一些人提出细胞凋亡在急性肾损伤中起重要作用，并有研究证 明，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(
5、 c a s p a s e 酶) 的广谱抑制剂或特异性拮 抗剂能够改善缺血再灌注及中毒性肾损伤。在脓毒症相关A K I 中，也有 人研究发现其肾组织损伤以细胞凋亡为主，但这一观点也被许多人所质 疑。因此凋亡在脓毒症相关急性肾损伤中是否起着关键作用还存在争议。 凋亡可由多种应激原如炎症因子、缺血、氧化应激、紫外线等诱因作 用下触发。C a s p a s e 酶级联反应在凋亡复杂过程的大多调制因子中，居于 核心地位。而c a s p a s e 3 是半胱氨酸蛋白酶家族( c a s p a s e 家族) 中关键酶之 一，通常以无活性的酶原形式存在。活化后的c a s p a s e 3 可
6、使细胞质、细胞 核及细胞骨架的重要蛋白质降解失活。A c D E V D C H O 是一种人工合成的 非生物性抑制剂，能竞争性与c a s p a s e 3 结合阻断c a s p a s e 3 对底物蛋白质的 降解作用，从而抑制c a s p a s e 3 介导的细胞凋亡，起到器官保护作用。 本研究旨在采用盲肠结扎穿：j ：l , ( C e c a lL i g a t i o na n dP u n c t u r e ，C L P ) 法复 制脓毒症相关急性肾损伤( a c u t ek i d n e yi n j u r y ，g I O ) 模型，应用免疫组化 法( i
7、m m u n o h i s t o c h e m i s t y ) 、流式细胞术( f l o wc y t o m e t r y ，F C M ) 等方法检测凋 亡抑制剂A c D E V D C H O 对肾组织凋亡相关因子c a s p a s e 3 、B c l 2 、B a x 等 蛋白表达的影响，探讨c a s p a s e 一3 抑制剂A c D E V D C H O 对脓毒症急性肾损 中文摘要 伤小鼠的肾保护性作用，并对其可能机制进行初步研究。 方法：本研究采用盲肠结扎穿j ：L ( C e c a lL i g a t i o na n dP u n c t
8、u r e ，C L P ) 法 复制小鼠脓毒症致A 模型。健康清洁级雄性C 5 7 B L 6 小鼠7 2 只，随机分 为3 组( n _ 2 4 ) ，假手术组( s h a mg r o u p ) ：只开腹，翻动肠管，牵拉盲肠后关 腹，不结扎和穿孔盲肠；盲肠结扎穿孔组( C L Pg r o u p ) ：进行盲肠结扎穿 孔术；( 查) C a s p a s e 3 抑制剂早期干预组( C a s p a s e 3i n h i b i t o rg r o u p ) ：先进行 盲肠结扎穿孔术，术后3 0 m i n 立即给予4 t g gA c D E V D C H O 凋亡
9、抑制剂溶 于1 D M S O 液中，腹部皮下注射。各组术后均给予3 7 ( 2 “生理盐水 3 0 m l k g 股部皮下注射，并于术后3 小时给予“亚胺培南西司他丁钠”2 5 m g k g ，腹部 皮下注射一次，然后以相同剂量Q 1 2 h r x 2 天。三组分别在术后6h 、1 2 h 、 2 4h 后通过摘眼球法采血( 每组每个时间点各8 只) ，各组取血标本离心后取 血清于8 0 冻存，用于测定血清中的肌酐、尿素氮水平。同时取肾脏分 为三部分，1 2 左肾放入1 0 中性福尔马林中固定2 4 至4 8 d x 时后石蜡包被， 用于光镜检测及病理损伤评分；另外1 2 左肾放入4
10、多聚甲醛中固定2 4 至 4 8 d x 时后石蜡包被，用于免疫组化法检测c a s p a s e 3 、B a x 、B c l 2 蛋白表达 及定位；右肾放入7 0 的乙醇中固定2 4 至4 8 小时，用于流式细胞术检测肾 细胞凋亡率以及B a x 、B c l 2 蛋白表达。 数据统计分析采用S P S S13 0 版软件包( S P S SC o m p a n y ， C h i c a g o ， I l l i n o i s ，U S A ) 进行；数据均以均数士标准差( 爻士s ) 表示，多个独立样本非 参数检验采用K r u s k a l W a l l i sH 检验
11、；多个样本均数间比较采用完全随机 设计的单因素方差分析，多个均数间两两比较采用L S D t 检验或S - N K 检验，方差不齐用对数转换和K r u s k a l W a l l i sH 检验，P O 0 5 为差异有 统计学意义。 结果： 1 实验动物一般情况和肾脏大体形态的观察 S h a m 组小鼠术后很快清醒且活动灵活；可自由饮水、进食；皮毛顺 滑，双眼分泌物少或无；剖腹可见腹腔结构清晰，无异常腹水及恶臭味， 肠管表面光滑湿润。C L P 组小鼠术后苏醒延迟且精神萎靡，活动迟缓；进 食较少；竖毛明显，双眼分泌物较多。剖腹可见淡血性腹水量多，有恶臭； 肠管水肿充血，腹腔肠管结构不
12、清，组织粘连，部分盲肠末端发黑。C I 组小鼠术后一般情况介于前两者之间。 中文摘要 S h a m 组肾脏颜色红润，色泽较暗；C L P 组肾脏水肿充血明显，色泽 鲜红；C I 组肾脏略水肿，充血较C L P 组不明显，色泽介于前两者之间。 2 组织病理变化( H E 染色) 及肾脏组织损伤病理评分结果 肾脏组织病理变化( H E 染色) ：s h a m 组：光镜下肾组织形态基本正常； C L P 组：肾小球及肾小管明显充血，肾小管上皮细胞体积增大，胞浆内可 见明显空泡变性和玻璃样变性，并伴有炎细胞浸润；C I 组：肾小管上皮 细胞损伤较C L P 组明显减轻，少量细胞出现轻微肿胀、脱落及
13、空泡变性， 肾小管形状保持较好。 肾脏组织损伤病理评分结果：术后6 hC L P 组病理损伤评分明显高于 s h a m 组及C I 组俨 O 0 5 ) ；术后1 2 h 、 2 4 h 均有相似结果( 尸 O 0 5 ) 。 3 各组小鼠肾功能血清C r 及B U N 结果 术后6 hC r t 直C L P 组较s h a m 组明显升高俨 0 0 5 ) 。 S h a m 组与C L P 组C r 在术后6 h 、1 2 h 、2 4 h 随时间呈下降趋势，但无统计 学差异( 尸 O 0 5 ) 。C I 组C r 值术后随时间也呈下降趋势，且术后2 4 h 较6 h 下 降明显伊
14、O 0 5 ) 。 术后6 hB U N 值C L P 组较s h a m 组明显升高( P O 0 5 ) 。 S h a m 组内B U N 在术后6 h 、1 2 h 、2 4 h 随时间呈下降趋势，但无统计学差 异( 尸 O 0 5 ) 。C L P 组B U N 在术后1 2 h 较6 h 、2 4 h 增高，但三者无统计学差异 伊 O 0 5 ) 。C I 组与C L P 组有相似结果。 4 各组肾组织细胞凋亡率检测结果 术后6 h 肾小管上皮细胞凋亡率C L P 组较s h a m 组明显升高( 尸 O 0 1 ) ，C I 组明显降低了C L P 升高的细胞凋亡率俨 O 0 1 ) ，与s h a m 组相比也显著升高 【P O 0 5 ) ；C L P 组随时间也呈下降趋势，且2 4 h 与6 h 相比明显下降( 尸 O 0 1 ) ；C
