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1、 博士学位论文 中中 文文 摘摘 要要 大鼠胚胎后肾原基同种和异种移植 器官形成及诱导免疫耐受的初步研究 浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科 2002 级博士研究生级博士研究生 徐剑徐剑 导导 师师 郑树森郑树森 院士院士 第一部分 大鼠胚胎后肾原基同种移植器官形成及异种移植研究 前 言 移植技术的改进、UW 液和新型免疫抑制剂的研发和应用以来，临床器官移植的长期 存活率得到明显提高， 并已成为终末期器官功能衰竭病人的最佳治疗方案。 扩大供体来源 和诱导免疫耐受是目前研究的重点。 胚胎后肾原基移植则为器官移植揭开了新的一页， 胚胎后肾原基 （Metanep
2、hros Anlage / Metanephros Primordium /Kidney Anlage） （肾脏原基）同种异体不但可以形成具有功能的 器官，而且可以诱导免疫耐受。由于未血管化的胚胎后肾类似细胞移植，可以躲避超急性 排斥反应，应用于异种移植获得成功。 为探索胚胎后肾原基同种和异种移植条件，在第一部分的实验中，我们首先对不同胎 龄胚胎后肾移植条件进行筛选，并使用环孢霉素 A（Cyclosporine A，CsA）进行了这方面 的实验研究。探讨 CsA 对胚胎后肾在同种和异种成年鼠体内器官形成和功能发挥的影响。 材料与方法 远交系SD成年大鼠或近交系Lewis （RT1l） 大鼠雌雄
3、之间同系雌雄之间同笼配种一整夜， 次日早晨雌性大鼠出现阴道栓提示受孕成功， 该日视作受孕第 0 天 （Embryonic day0， E0） 。 分别取受孕第 14、15、16、17、18 和 19 天（E14、E15、E16、E17、E18、E19）的胚胎 立即置于 04冷生理盐水或等量DMEM：Hams F12 人工培养基中，从胚胎中提取胚胎 后肾， 1525 分钟内植入成年大鼠网膜，并分组进行实验。 1 博士学位论文 1 不使用 CsA 大鼠胚胎后肾同种移植条件的筛选： 远交系 SD 大鼠胚胎后肾作为供体， 按照植入胚胎后肾胚龄分为 E14、 E15、 E16、 E17、 E18 和 E
4、19 组共 6 组。将胚胎成对后肾植入远交系成年 SD 大鼠（SDSD）大网膜，宿主 鼠切除左肾。对照组肾不切除。移植后 28 天开腹观察实际存活大鼠的器官形成情况，并取 标本进行组织病理学、生化检测。 2 使用 CsA 同种胚胎后肾植入成年大鼠网膜： 将 SD 孕鼠 E15、E16、E17 胚胎按照使用 CsA（E15CsASD、E16CsASD、E17CsASD） 和不使用 CsA（E15SD、E16SD、E17SD）分组移植到行单侧肾脏切除的成年 SD 大鼠的网 膜（SDSD） 。为观察主要组织相容复合物（MHC）不同的品系间（LewisBN）移植胚 胎后肾能否形成器官，取 Lewis
5、孕鼠 E15 后肾按照使用 CsA（E15CsABN）和不使用 CsA （E15BN）分组移植到行单侧肾脏切除的成年受体 BN 大鼠网膜。使用 CsA 组受体大鼠以 CsA8mg/kg/d 皮下注射；不使用 CsA 组受体大鼠以等量的生理盐水皮下给药。移植后分期 开腹观察存活大鼠的器官形成情况，并取标本进行组织病理学、后肾功能等检测。 3 大鼠胚胎后肾植入小鼠大网膜： 近交系C57BL/6 (H-2b)小鼠作为受体。将Lewis孕鼠E15、E16、E17 胚胎分组移植到行 单侧肾脏切除的成年C57BL/6 小鼠的网膜（LewisC57BL/6） ，以CsA12mg/kg/d皮下注射。 移植后
6、14 天开腹观察存活小鼠的器官形成情况，并取标本进行组织病理学检查。 结 果 1. 不同胎龄大鼠胚胎后肾组织学检查 E15 后肾最大径约 700 m，包含输尿管芽分支及浓聚的生后肾母基、少量 S 形小体和 逗号小体，但是不含肾小体。 E14 后肾比 E15 后肾小，约 400 m，只有原始的输尿管芽 及正在浓聚的生后肾母基，不含 S 形小体和逗号小体。E16、E17 后肾的皮质和髓质初具雏 形，原始皮质区含有生后肾母基、S 形小体和逗号小体；输尿管芽分支较少。E17 后肾最 大径约 1.5mm， 皮质区内有较多的分层， 已出现原始的肾小体， 肾小管结构发育不明显， E16 后肾较 E17 后肾
7、小，最大径约 1.0mm，分层少，原始肾小体很少。E18、E19 后肾具有各期 发育的肾单位，输尿管芽分支较多。E19 后肾最大径不到 3mm，可区分皮质和髓质，皮质 区内已出现成熟的肾小管结构，并可见髓放线；E18 后肾较 E19 后肾小，具有 35 代发育 2 博士学位论文 各期的肾小体，但未见成熟的肾小管和髓放线。 2不使用 CsA 大鼠胚胎后肾同种移植 移植后 28 天，E18、E19 后肾增大明显，形态类似宿主肾，但质地硬，病理显示几乎 完全被纤维结缔组织替代，其间散布着较多的淋巴细胞，部分标本中可见管状结构和细胞 残。少数标本尚可见硬化的肾小球残迹。宿主成年 SD 大鼠网膜中生长的
8、 E16、E17 后肾血 供良好，形态类似宿主肾，但质地仍较硬，输尿管发育完好，病理显示肾小球及近端小管、 远端小管和集合管发育良好，输尿管变移上皮和平滑肌层清晰、完整。但是，发育的后肾 间质、肾血管球、肾小管结构中有程度不等的单核细胞浸润，以淋巴细胞为主，提示已发 生移植排斥反应。E16 移植后肾组排斥反应较轻，以 Banff 轻度急性排斥反应为主；E17 则 较重，以中度和重度急性排斥反应为主。E14、E15 后肾血供良好，呈肾形，质地软，皮质 和髓质都清楚显现，皮质中包含发育完好的肾小球，近端小管（伴有发育完好的刷状缘） 和远端小管。髓质中包含有发育完好的集合管，偶见间质中有淋巴细胞，但
9、是，肾小管和 血管成分少有淋巴细胞浸润，E15 组 Banff 排斥强度分级与 E16 组（P0.05） 。 不使用免疫抑制剂将胚胎后肾植入肾蒂周围，28 天后检查后肾标本，色泽和质地及病 理改变与 E15 后肾网膜移植组类似，且淋巴细胞浸润很少。 移植时宿主肾脏不切除而植入胚胎后肾，其后肾不发育或者极其缓慢。移植 28 天检查 移植部位未发现后肾或仅仅有米粒大小的白色硬结，病理为疤痕结缔组织。 部分 E15、E16 后肾出现输尿管或肾盂积液现象，抽吸的积液呈淡黄色、澄清。移植 后肾积液的尿素氮（P0.01） 、肌酐值（P0.01）与动脉血清比较分别增加 40 倍和 50 倍； 积液尿素氮（P
10、0.05）与尿液中浓度接近。 3 使用环孢霉素 A 同种胚胎后肾植入成年大鼠网膜 移植后 28d，E15CsASD、E16CsASD、E17CsASD 组后肾及输尿管发育良好。10 只 E16CsASD 组大鼠除 4 只有临界改变，其余 6 只未发现排斥反应；存活的 8 只 E17CsASD 组 大鼠临界改变 5 只，其余正常。存活的 10 只 E15CsASD 组大鼠未发现排斥反应。到 100 天 时，E15CsASD、E16CsASD、E17CsASD 组大鼠后肾形态和结构基本保持正常，但已有部分 淋巴细胞浸润，集合管周围的间质增生明显。若停用 CsA21d 后，发育良好的后肾则被完全 3
11、 博士学位论文 排斥。 对照组 E16SD 组和 E17SD 组大鼠发生移植排斥反应。E16SD 组大鼠排斥反应较轻，存 活的 8 只临界改变 2 只、轻度 4 只、中度 2 只；E17SD 组则较重，10 只大鼠中度和重度急性 排斥反应分别为 4 只和 6 只。E16CsASD 与 E16SD（P0.01） ，E17CsASD 与 E17SD 组之间 Banff 排斥强度分级差异有统计学意义（P0.01） 。 移植后 28 天， 存活的 8 只 E15SD 组后肾血供良好， 形态、 结构与使用 CsA 的 E16CsASD、 E17CsASD 组类似，但到移植后 100 天时，发育的 E15
12、SD 后肾都已经发生排斥反应（n=6） 。 不使用免疫抑制剂，E15BN 后肾移植后 14 天即完全被宿主排斥（n=15） ，HE 染色检查 显示为疤痕结缔组织，部分切片中可见硬化的肾小球和肾小管残迹。而 E15CsABN 后肾则发 育良好（n=12） ，后肾形态和结构正常。若停用 CsA14 天后，发育完好的 E15CsABN 后肾则 被完全排斥（n=5） 。 移植后肾的功能检测：E15CsASD 组移植后肾湿重(P0.01)、体积(P0.05)小于 E15SD 组，但是内生肌酐清除率(P0.01)却较高。E16CsASD 组与 E15CsASD 组移植后肾湿重 ( P 0.05)、体积(
13、P0.05)及内生肌酐清除率( P0.05 )比较差异无统计学意义。 4大鼠胚胎后肾植入成年小鼠大网膜 植入 C57BL/6 小鼠网膜 14 天后，Lewis 大鼠 E14、E15、E16 组后肾增大明显，形态 类似宿主肾，但质地硬，病理显示几乎完全被纤维结缔组织替代，其间散布着较多的淋巴 细胞。 结 论 1 不使用免疫抑制剂的 SD 大鼠的 E14、E15 组后肾原基在同种 SD 成年大鼠体内能够再 血管化，形成器官并具有一定的泌尿功能。 2 CsA 8mg/kg/d 腹腔给药，E15、E16、E17 胚胎后肾可以在同种成年大鼠网膜内形成器 官并发挥功能。 3 CsA 12mg/kg/d 腹
14、腔给药， Lewis 大鼠 E14、 E15、 E16 胚胎后肾原基未能在异种 C57BL/6 成年小鼠网膜内形成器官。 4 多种因素影响胚胎后肾的同种和异种移植效果，但是排斥反应仍然是最主要的制约。 关键词：胚胎；后肾；同种移植；异种移植；器官形成关键词：胚胎；后肾；同种移植；异种移植；器官形成 4 博士学位论文 第二部分 大鼠胚胎后肾原基 HTK 液冷保存后同种移植器官形成 前 言 第一部分的研究结果表明，不使用免疫抑制剂的 SD 大鼠的 E14、E15 组移植后肾在同 种 SD 成年大鼠体内能够再血管化，形成器官并具有一定的泌尿功能。使用环孢霉素 A 8mg/kg/d 腹腔给药，E15、
15、E16、E17 胚胎后肾可以在同种成年大鼠网膜内形成器官并发挥 功能。这为进一步实验提供了研究的基础和可能性。 在实验和临床实际操作中，供体胚胎后肾往往需要保存一段时间。我们运用 HistidineTryptophanKetoglutarate(HTK)液体外保存胚胎后肾进行了这方面的实验研究， 探 讨 HTK 液对胚胎后肾在同种异体成年大鼠体内器官形成和功能发挥的影响，并与 UW 液 比较了对胚胎后肾的保存效果。 材料与方法 怀孕大鼠无菌操作下，从子宫中摘取胚胎，解剖、清理胚胎后肾，置于 04冷 HTK 液或 UW（University of Wisconsin）液中保存。 1. 使用 Cs
16、A，HTK 液冷保存大鼠胚胎后肾同种异体移植 将 SD 大鼠受孕第 16、17 天（E16、E17）胚胎后肾以 HTK 液体外保存 3 天，分组移 植到行单侧肾脏切除的成年 SD 大鼠的网膜。 术后 CsA 8mg/kg/d 皮下注射， 移植 34 周后 开腹观察器官形成情况，并进行后肾组织病理学、电镜和后肾功能检查。 2. HTK 液与 UW 液冷保存大鼠胚胎后肾的效果比较 将近交系Lewis(RT11)大鼠E16 置于含有各 200l的HTK液或UW液的 96 孔细胞培养板 中 04冷保存，分期取 0，24，48，72 及 96 小时的保存液 4冷藏，对应的胚胎后肾组 织标号后78超低温冰箱冻存。测定胚胎后肾组织细胞活性：乳酸脱氢酶（LDH）释放 率和三磷酸腺苷（ATP）含量
