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1、T h eR e s e a r c ho nI S S RM o l e c u l a r M a r k e ra n d T i s s u eC u l t u r eo f N e w V a r i e t i e so fL o n i c e r am a c r a n t h o i d e s Ad i s s e r t a t i o ns u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e R e q u i r e m e n t sf o r t h ed e g r e eo f D
2、o c t o ro fA g r i c u l t u r e S i l v i c u l t u r e m C e n t r a lS o u t hU n i v e r s i t yo fF o r e s t r ya n dT e c h n o l o g y 4 9 8S h a o s h a nS o u t hR o a d ，T i a n x i n D i s t r i c t C h a n g s h aH u n a n 4 1 0 0 0 4 ，P R C H I N A S u p e r v i s o r P r o f e s s o
3、rX I EB i x i a J u n e ，2 0 1 2 _I。卜_，。，誓 ：I J 中南林业科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品，也不包含为 获得中南林业科技大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材 料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式表明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：万迕唧 沙少年6 月彦名 中南林业科技大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保
4、留、使用学位论文 的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件或电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权中南林 业科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存和汇编本学位论文。 本学位论文属于： l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请您在以上相应方框打“”) 作者签名：；必J 枷1 1 导师签名：鞠撒秀 沙年否月歹一 幻忡6 月专日 博士学位论文灰毡毛忍冬新品种I S S R 分子标记及组织培养的研究 摘要 灰毡毛忍冬( L o n i c e r am a c r a n t h o i d
5、 e sH a n d - M a z z ) 又名拟大花忍冬、大银花等， 是忍冬科忍冬属多年生半常绿小灌木植物，其花蕾绿原酸含量在全国各种药用忍冬植 物中最高，是湖南、重庆、贵州等地药用忍冬植物生产的主栽品种。虽然我国药用忍 冬植物产业取得了长足的发展，但是，仍存在着良种缺乏，品种混杂，干花产量和药 用活性成份绿原酸含量低，繁殖技术落后，育苗周期长，繁殖系数小等系列问题，从 而制约了我国药用忍冬植物产业健康可持续发展。本文以灰毡毛忍冬新品种金翠 蕾、银翠蕾和白云为研究对象，研究了灰毡毛忍冬新品种I S S R 分子标记和组织培 养，系统地分析了新品种组织培养增殖分化及生根过程中的内源激素、内
6、源多胺的变 化规律和调控作用，旨有效地从分子水平鉴别灰毡毛忍冬新品种，建立新品种高效组 培快繁技术体系，促进我国药用忍冬植物产业又好又快发展。主要研究结果如下： ( 1 ) 灰毡毛忍冬新品种I S S R 分子标记的研究。以灰毡毛忍冬叶片基因组D N A 为 模板，研究了退火温度、T a qD N A 聚合酶的用量及模板D N A 、引物、d N T P s 、M 9 2 + 浓度等6 种因素对I S S R - - P C R 扩增的影响，建立了灰毡毛忍冬I S S R P C R 的优化反应体 系和扩增程序。利用优化的反应体系，从1 0 0 条I S S R 弓 物中筛选出l o 条能够扩
7、增出清 晰、稳定条带的引物。以该1 0 条引物对3 个灰毡毛忍冬新品种和其它1 9 个药用忍冬植 物品种基因组D N A 扩增，共扩增出1 0 8 条带，其中多态性条带9 6 条，多态性条带比率 为8 8 9 ，说明药用忍冬植物的遗传多样性丰富。并利用该体系构建3 个灰毡毛忍冬新 品种和其它1 9 个药用忍冬植物品种D N A 指纹图谱，可从分子水平将3 个新品种与现在 药用忍冬植物品种进行鉴别；利用U P G l A 和主成分分析，将2 2 个供试药用忍冬植物 品种划分为忍冬种群和灰毡毛忍冬种群2 个大类，每一大类又分为北方种群与南方种 群。研究发现，不同药用忍冬植物品种之间的遗传差异与地理
8、环境的差异存在相关性。 ( 2 ) 灰毡毛忍冬新品种组织培养的研究。以灰毡毛忍冬新品种金翠蕾、银翠蕾 和白云为研究对象，采用单因素、双因素试验和正交试验设计，开展了外植体选择、 灭菌处理、基本培养基、植物激素及其配比、D 生物素浓度、活性炭浓度、培养温度、 移栽基质、移栽容器、组培生根苗消毒处理、降低生产成本措施等系列试验，建立了 组织培养的无菌体系，获得了适宜的初代培养基：金翠蕾和银翠蕾为M S + 6 B A l 0 m g L 1 + N A A 0 1m g L 1 ，白云则为M S + 6 B A l 0m g L 1 + m A o 1m g L - 1 ；筛选出适宜的 继代培养基
9、：金翠蕾为改良M S + 6 - B A 0 5m g L 1 + N A A 0 1m g L - 1 + D 生物素1 0m g L 一， 银翠蕾为改良M S + 6 B A 0 5m g L 1 + N A A 0 0 5 + D 生物素1 0m g L 1 ，白云则为改良 M S + 6 B A l 0m g L 1 + I B A 0 1m g L - 1 + D 生物素o 5m g L 1 ，平均增殖系数4 6 5 ；研究发 博士学位论文 灰毡毛忍冬新品种I S S R 分子标记及组织培养的研究 现适当低温有利于诱导灰毡毛忍冬组培苗生根，找到了其组培苗生根培养的适宜温度 为2 0
10、：筛选出3 个品种适宜的生根培养基是1 2 M S + I B A 3 0m g L - 1 + A C2 1 0m g U 1 ， 平均生根率9 7 4 。同时以金翠蕾叶片为外植体，诱导出了愈伤组织和不定芽，筛选 出了叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为：B 5 + 6 B A1 0m g L 1 + 2 ，4 D0 5m g L - 1 ，愈 伤组织诱导率为8 6 7 ；诱导不定芽的最佳培养基为：B 5 + K TO 2m g L 1 + N A A1 0 m g L - 1 ，不定芽诱导率为7 3 4 。研究出组培苗“塑料杯单株一步移栽”技术，适宜移 栽基质为黄心土+ 糠壳灰+ 细砂( 1 ：
11、2 ：2 ) ，平均移栽达成活率达9 5 以上。用凉开 水替代蒸馏水，白砂糖代替蔗糖配制培养基，可显著降低了组培苗生产成本，提高了 灰毡毛忍冬新品种工厂化育苗的生产效益。 ( 3 ) 灰毡毛忍冬新品种组培苗扦插繁殖技术的研究。以灰毡毛忍冬新品种金翠 蕾组培苗为试验材料，开展了不同的扦插基质、扦插时期、植物生长调节剂、A B T 6 浓度及浸泡时间对灰毡毛忍冬新品种组培苗扦插繁殖的影响试验，研究结果表明，扦 插基质以泥炭土+ 珍珠岩( 体积比1 ：3 ) 为宜，适宜的扦插时期是5 月和9 月，适宜 的植物生长调节剂是3 0 0m g L - 1 的A B T 6 浸泡插穗1 2 0 r a i
12、n ，扦插成活率达9 5 以上， 大幅度降低了灰毡毛忍冬新品种组培苗生产成本。 ( 4 ) 灰毡毛忍冬新品种组织培养过程内源激素变化的研究。以金翠蕾组培苗为 试验材料，分析了组培苗增殖分化、生根及愈伤组织和不定芽诱导过程的内源激素含 量变化，研究了6 - B A 浓度对继代培养组培苗、I B A 浓度对生根培养组培苗内源激素 含量的影响。结果表明：灰毡毛忍冬组培苗继代增殖分化主要受内源Z R 、A B A 和 G A 3 调控，较高浓度的Z R 、G A 3 和较低A B A 有利于灰毡毛忍冬组培苗继代增殖分化， 适当高浓度的I A A 对丛芽增殖分化和生长也有利，但作用不明显，而较高I P
13、A 含量 有利于灰毡毛忍冬外植体启动培养，但与增殖分化关系不密切。内源激素平衡关系中 是G A 3 Z R 值主导组培苗增殖分化，较高的G A a Z R 值有利于启动组培苗增殖分化和 生长，而增殖分化盛期则需要较低的G A 3 Z R 值，G A 3 A B A 值也表现了类似效应。 在灰毡毛忍冬组培苗不定根的形成过程中，不同的内源激素对不定根形成的作用不 同。较高浓度内源I A A 、A B A 和较低浓度的内源G A 3 、I P A 、Z R 有利于根原基的分 化形成，促进了组培苗不定根的形成。而较高浓度的内源I A A 、G A 3 、Z R 、I P A 和较 低浓度的内源A B
14、A 有利于根原基的生长发育。内源激素的平衡关系也协同参与灰毡 毛忍冬组培苗根原基分化形成及生长发育。较低的( Z R + P A ) I A A 值和较高的 I A A A B A 、A B A G A 3 值有利于根原基的分化形成，较高( Z R + t P A y t A A 值和较低 A B A G A 3 值有助于根原基生长发育。不同的内源激素在灰毡毛忍冬愈伤组织和不 定芽诱导过程中的作用不同。低浓度的内源G A 3 、I A A 、Z R 、A B A 有利于愈伤组织 的诱导，而高浓度的内源G A 3 、认A 、Z R 促进了愈伤组织的生长。不定芽诱导主要 博士学位论文 灰毡毛忍冬新
15、品种I S S R 分子标记及组织培养的研究 受内源I A A 和A B A 调控，低水平的内源认A 、A B A 、Z R 、G A 3 含量有助于愈伤组 织分化成不定芽。 ( 5 ) 灰毡毛忍冬新品种组织培养过程多胺变化的研究。以金翠蕾组培苗为试验 材料，分析了组培苗增殖分化、生根过程的内源多胺含量变化，研究了6 - B A 浓度对 继代培养组培苗、I B A 浓度对生根培养组培苗内源多胺含量的影响。结果表明：不 同的内源多胺在灰毡毛忍冬组培苗增殖分化过程中有不同效应。组培苗增殖分化主要 与S p d 、P u t 含量和P u f f S p m 值关系密切，与S p i n 含量和P
16、u t S p d 值、P u t ( S p d + S p m ) 值 关系不大；高水平的S p d 、P u t 含量和P u t S p m 值有利于组培苗增殖分化的启动，而 增殖分化盛期则需要维持较低水平的P u t 、S p d 含量和P u V S p m 值。P u t 、S p d 、S p i n 及其平衡关系在灰毡毛忍冬组培苗根原基的分化形成与生长发育过程中的作用各异。 高水平的P u t 、S p m 含量和P u f f S p d 值、P u t ( S p d + S p m ) 值有利于组培苗根原基的分化 形成，而低水平的P u t 、S p m 含量和P u f f S p d 值、P u “( S p d + S p m ) 值则促进根原基的生 长发育。低水平的S p d 含量和P u t S p
