鸡鲍氏志贺菌疫苗免疫抗体间接elisa定量检测方法的建立及应用

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1、河南农业大学 硕士学位论文 鸡鲍氏志贺菌疫苗免疫抗体间接ELISA定量检测方法的建立及应 用 姓名：李凯 申请学位级别：硕士 专业：预防兽医学 指导教师：许兰菊 20090601 河南农业大学2 0 0 9 届硕士论文 中文摘要 鸡鲍氏志贺氏菌病是近年所发现的鸡的一种新发传染病，该病是由鸡鲍氏志贺氏茵引起 的一种急性传染病，可使不同品种、不同日龄的鸡发生腹泻，并可引起幼雏大批发病和死亡。 且有关研究结果已表明：志贺氏菌可在人禽间造成交互感染。因此，对该病展开研究不但具 有重要的兽医卫生学意义，而且具有重大的医学公共卫生学意义。本研究通过建立间接 E L I S A 方法，并应用于鸡鲍氏志贺氏菌

2、灭活疫苗免疫鸡血清抗体的检测，为正确评价疫苗 免疫效果、制定合理免疫程序、有效预防和控制本病提供了准确可靠的血清学检测手段和方 法。研究结果如下： 1 间接E L I S A 方法的建立 本研究以甲醛灭活的鸡鲍氏志贺氏菌全菌体为包被抗原，以辣根过氧化物酶( H R P ) 标 记的兔抗鸡I g G 为二抗，成功建立了检测鸡鲍氏志贺氏菌灭活疫苗免疫抗体的间接E L I S A 方法，并确定了E L I S A 的最佳工作条件：抗原包被浓度为1 0 8 c f u m l ，最佳包被温度为4 1 2 h ； 最佳封闭条件为1 B S A 3 7 封闭2 h ；血清最佳稀释度为1 ：1 6 0 ；二

3、抗最佳稀释度为1 ：4 0 0 0 ， 最佳工作条件为3 7 1 h ：底物最佳：【作条件为3 7 2 0 m i n 。通过交叉试验、特异性试验、 敏感性试验、重复性试验等结果表明该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。其 中板内变异系数0 3 6 0 6 4 ，板间变异系数为1 0 5 1 8 5 ；包被的全菌体抗原与其他 腹泻病原的抗体无交叉反应，阻断结果为阡I 性；间接E L I S A 方法灵敏度是微量凝集试验的 8 0 1 6 0 倍。 分别检测2 0 份阳性鸡血清不同稀释度的O D 值，发现刚性血清O D 值与血清中E L I S A 效价倒数的对数之间均存在线性相关性。根

4、据拟和的标准曲线，确定回归方程为：i o g E T 倒数】= 1 7 7 6 + 1 9 2 1 x 。回归方程的建立为临床免疫后根据血清O D 值米预测和分析抗体水平 提供了数学模型。 2 间接E L I S A 方法应用于鸡鲍氏志贺氏菌灭活疫苗免疫鸡血清抗体检测 为了评价鸡鲍氏志贺氏菌灭活疫苗的体液免疫效果，应用建立的间接E L I S A 方法对疫 苗免疫后的鸡血清抗体进行检测，结果表明免疫组鸡群的免疫抗体效价明显高于同期的未免 疫对照组( p 阴性样本O D 均值( X ) + 3 S D 时，可以在9 9 的水平 上判为阳性。所测数据经统计学处理，样品的平均值和标准差为：X = 0

5、 2 1 2S D = 0 0 0 8 2 6 ，则 河南农业大学2 0 0 9 届硕士论文 阴性临界值等于0 2 3 7 。 3 2 2 标准曲线与回归方程的建立 经测定，包被鸡鲍氏志贺氏菌全菌体抗原时，阴性血清的临界值为0 2 3 7 。2 0 份血清1 ：1 6 0 稀释时的O D 值与其E L I S A 效价见表9 。 表9 血清O D 值与E L I S A 效价 T a b l e9O Dv a l u ea n dE L l S At i t e r so f a n t i b o d i e s 经C u r v e E x p e r t1 3 分析证实，血清E L I

6、S A 效价倒数的对数与血清1 ：1 6 0 倍稀释时的O D 值之间存在一定的相关性。血清1 ：1 6 0 倍稀释时的O D 值与E L I S A 效价倒数的对数用图表 示，得出标准曲线，见图2 。 河南农业大学2 0 0 9 届硕士论文 S = O 1 0 3 1 6 9 们 r = 0 9 7 4 鹤1 XA x i s u n i t s ) 0 D4 5 0 n m 图2 标准曲线 F i g2S t a n d a r dc u r v eo f s e r o t y p e 经分析测定，相关系数r = O 9 7 1 ，a = 1 7 7 6 ，b = 1 9 2 1 ，x

7、代表待测样本O D 值，因此同归 方程为： I o g E T 倒数】- 1 7 7 6 + 1 9 2 1x 当某一待检血清在l ：1 6 0 倍稀释时的O D 值测定出后，该血清的效价可以直接解网归方 程求出。 表l O 血清实测效价与预测效价的比较 T a b l e1 0C o m p a r i s o no f d e t e c t e dt i t e ma n dp r e d i c t e dt i t e r s 3 2 3 特异性试验 3 2 3 1 阻断试验结果见表l l 。 3 2 (s兰吧：一岍Ix卜； 河南农业大学2 0 0 9 届硕士论文 由表1 1 所示用

8、鸡鲍氏志贺氏菌全菌体抗原阻断后的阳性血清O D 值明显低于未阻断的 对照阳性血清，而且阻断率均大于0 5 ，表明反应具有良好特异性。 3 2 3 2 交叉试验结果见表1 2 。 表1 2 交叉试验结果 T z I b l e1 2T h er e s u l t so f s c r a - c r o s st e s t 由表1 2 所示用鸡鲍氏志贺氏茵全菌体作为包被抗原对不同血清进行检测除鸡鲍氏志贺 氏茵阳性血清外均为阴性，说明方法特异性较好，不与其他抗体发生交叉反应。 3 2 4 敏感性试验结果见表1 3 。 表1 3 敏感性试验结果 T a b l e13T h er e s u l

9、 t so fs e n s i t i v i t yt e s 由表1 3 所示，用已建立的间接E L I S A 所测的鸡鲍氏志贺氏菌免疫抗体效价比微量凝集 试验敏感8 0 “ “ 1 6 0 倍，说明该方法具有较高的敏感性。 3 2 5 重复性试验 3 2 5 1 批内重复性试验结果见表1 4 。 3 3 河南农业大学2 0 0 9 届硕士论文 由表1 4 所示，以鸡鲍氏志贺氏菌全菌体作为包被抗原时，试验结果经统计学分析，板 内变异系数在O 3 6 0 6 4 之间，小于1 0 ，说明同一样品在同一批次试验中变异程度较 小，表明该方法具有良好的重复性。 3 2 5 2 批问重复试验结果

10、见表1 5 。 表1 5 批问重复试验 T a b l e15T h ei n t e r - b a t c hd u p l i c a t i v i t yt e s t 由表1 5 所示，以鸡鲍氏志贺氏菌全菌体作为包被抗原时，试验结果经统计学分析，板 内变异系数在1 0 5 1 8 5 之间，明显小于1 5 ，说明同一样品在不同批次试验中变异程 度较小，表明该方法具有良好的重复性。 河南农业大学2 0 0 9 届硕士论文 3 3 结论与讨论 3 3 1 结论 3 3 1 1 本研究以甲醛灭活的鸡鲍氏志贺氏菌全菌体为包被抗原，以辣根过氧化物酶( H R P ) 标记的兔抗鸡I g G

11、为二抗，成功建立了检测鸡鲍氏志贺氏菌灭活疫苗免疫抗体的间接E L I S A 方法，并确定了E L I S A 的最佳工作条件：抗原包被浓度为1 0 8 c f u m l ，最佳包被温度为4 “ C 1 2 h ； 最佳封闭条件为l B s A 3 7 封闭2 h ；血清最佳稀释度为1 ：1 6 0 ；二抗最佳稀释度为1 ：4 0 0 0 ， 最佳工作条件为3 7 l h ；底物最佳：L ：作条件为3 7 2 0 m i n 。 3 3 1 2 通过交叉试验、特异性试验、敏感性试验、重复性试验等结果表明该方法具有特异性 强、灵敏度高、重复性好等优点。其中板内变异系数0 3 6 - 一0 6

12、4 ，板间变异系数为1 0 5 1 8 5 ；包被的全菌体抗原与其他腹泻病原的抗体无交义反应，阻断结果为阳性；间接E L I S A 方法灵敏度是微量凝集试验的8 0 1 6 0 倍。 3 3 1 3 分别检测2 0 份阳性鸡血清不同稀释度的O D 值，发现阳性血清O D 值与血清中E L I S A 效价倒数的对数之间均存在线性相关性。根据拟和的标准曲线，确定回归方程为：l o g E T 倒数1 - 1 7 7 6 + 1 9 2 1 x 。同归方稃的建立为临床免疫后根据血清O D 值来预测利分析抗体水平 提供了数学模型。 3 3 2 讨论 酶联免疫吸附试验( E L I S A ) 是继

13、放射免疫测定( R I A ) 之后发展起米的一项新的免 疫学技术。E L I S A 由免疫反廊系统和检测系统两部分组成。在免疫反应系统中，抗原与抗 体反应，形成抗原抗体复合物。在检测系统中，将标记了指示剂的抗原( 抗体) 或抗抗体 加入到反应体系。E L I S A 技术中，刚作标记物的指示剂为生物酶，酶是一种生物催化剂， 可与其底物发生特异性催化反虑，生成的产物又可与另一种能产生颜色反应( 生色源) 或使 紫外吸光值变化( 供氢体) 的化台物发生氧化还原反应。最后，用仪器测定底物液的吸光值变 化，便可检出指示剂的变化情况，从而测定出微量有机物的含量I 坦2 。酶联免疫吸附试验 将酶促反应

14、的高效率和免疫反应的高度专一性有机地结合起来，可对生物体内各种微量有机 物的含量进行定量测定，是目前灵敏度高、适应性强、最有希望在生产和临床中推广应用的 免疫测定技术【1 2 2 1 。 目前，本室已经研制出鸡鲍氏志贺氏菌灭活铝胶疫苗和油乳剂疫苗。而用于该疫苗免疫 抗体测定的方法主要是平板微量凝集试验，尽管该方法在临床操作中简单、快速、方便，但 是存在灵敏度不高或不稳定等冈素，尤其是存在自凝与不凝问题，结果易受非特异性因素的 影响造成假阳性。而本试验所建立的间接E L I S A ，对最佳亡作条件进行了探索，并通过阻 断试验、交叉试验、敏感性试验和重复性试验，结果证明该方法不仅操作简单，快速而

15、且具 有特异性强、敏感度高、可重复性好等特点。该方法能快速准确测定鸡鲍氏志贺氏菌的免疫 抗体，这不仅为正确评价鸡鲍氏忠贺氏菌疫苗的免疫效果提供了有力的工具，也为制定合理 河南农业大学2 0 0 9 届硕士论文 的免疫程序提供了可靠的依据。 3 3 2 1 包被抗原选择。常见用于E L I S A 试验的包被抗原主要有英膜多糖、脂多糖、外 膜蛋白、超声波裂解菌体和全菌体等。英膜多糖是细菌细胞壁外的一种粘性外壳，脂多糖和 外膜蛋白是革兰氏阴性菌细胞壁的主要组成部分，是细菌非常重要的抗原成分，均可刺激机 体产生特异性免疫反应【坨3 2 4 1 。但是鸡鲍氏志贺氏菌不具有荚膜结构，因此不能作为包被抗

16、原用于疫苗免疫抗体的检测。自然感染或人工免疫鸡鲍氏志贺氏菌疫苗后产生的血清抗体， 是针对鸡鲍氏志贺氏菌所有抗原决定簇，若仅用脂多糖或外膜蛋白作为抗原包被酶标板，检 出的只是O 抗原或外膜蛋白所产生的抗体，并不是所有抗原决定簇所产生的抗体，不能全 面的检测出血清中鸡鲍氏志贺氏菌的抗体1 1 2 孓1 2 6 1 。在科研：r 作中，有许多研究者利用超声波 破碎细菌菌体并进一步纯化用作抗原包被酶标板，且取得了一定的结果。但有报道指出由于 细菌成份比较复杂，裂解的细菌细胞中含有很多与反应无关的成分，造成包被酶标板时所用 的浓度偏大，非特异性值偏高 1 2 L i 2 7 】。本试验采用甲醛灭活的鸡鲍氏志贺氏菌全菌体作为包 被抗原，能检测出脂多糖、外膜蛋白等抗原决定簇诱导机体产生的抗体，同时本试验结果也 证实，全菌体用作包被抗原可以获得满意的结果。这可能与全