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1、南方医科大学2 0 0 8 级硕士学位论文 高频低强度复合振动抑制破骨细胞分化的作用及机制 E f f e c t sa n dm e c h a n i s mo fl o w m a g n i t u d e ，h i 曲一f r e q u e n c y c o m p o u n d v i b r a t i o no no s t e o c l a s td i f f e r e n t i a t i o n 课题来源：广东省科技计划项目( N o 2 0 0 8 8 0 3 0 3 0 1 3 4 3 ) 专业名称骨外科学 学位申请人巫松辉 指导教师。陈建庭教授 答辩委
2、员会主席 答辩委员会成员 论文评阅人 钟世镇院士 蔡道章教授 黄东生教授 刘少喻教授 朱青安教授 廖威明教授 余楠生教授 2 011 年4 月2 6 日 广州 ，frr，l 细胞分化的 骨质疏松症( o s t e o p o r o s i s ，O P ) 是一种以骨量减少、骨组织微结构退化为特征， 以致骨的脆性增高而骨折危险性增加的一种全身性系统性代谢性骨病。据估计， 全球范围内现有2 亿多O P 患者，其中亚洲地区成为O P 高发地区，中国患者已 超过9 0 0 0 万。目前O P 在世界常见病、多发病中居第7 位。O P 导致的骨折等并 发症可致残、致死，治疗耗资大，给患者、家庭和社
3、会带来沉重的负担。随着 人口老年化，这情况显得更为突出。O P 不仅是一个医疗问题，也是一个需要迫切 关注的社会问题。当前对O P 的药物治疗以抑制骨吸收为主，少数药物可以促进 骨形成，但效果都不确切，且药物治疗存在较大副作用。W o l f f 定律认为，骨的 结构特点是适应功能需要而铸造的，并随着功能需要的改变而进行重建；骨的 功能是承受活动期间骨组织的机械应变，并随着功能需要所产生的应力的变化 而进行功能适应性重建；骨组织内骨细胞接受到的变化着的应力是这种重建的 原始动力。而低于引起骨组织损伤的机械振动信号具有很强的成骨效应，它不 仅可防止骨丢失，还可以改善骨结构和生物力学性能。因此，振
4、动疗法是一种 具有无创、副作用小的非药物治疗O P 的新型模式。 振动作为一种力学刺激，需要一定的频率和强度才能有效传递至成骨效应 细胞诱发成骨反应，过低的强度和频率难以到达有效部位或不能成为诱发成骨 的阈上刺激，而过高的振动强度对人体是有危害的。骨对机械信号很敏感，研 究证明短时间的振动能通过降低骨吸收，促进成骨细胞的增殖和分化，提高成 骨速度，增加松质骨量而提高骨的数量和质量。振动的成骨效应已经形成共识， 摘要 但其具体的机制尚不清楚。目前主要有骨血灌注，骨功能适应和振动在骨组织 的传导等观点，其确切的信号传导通路也不清楚。振动在改善骨质量的同时还 可在一定程度上预防或改善肌萎缩，维持或增
5、强肌力，有助于改善或增强平衡 能力。目前短时高频低强度的振动用于O P 相关研究已得到广泛关注。为了能更 好的适合人体解剖学特点，我们改良全身垂直振动方式研究设计了复合振动仪， 希望在改变振动方式的同时保持振动的成骨效应。其特点在于：1 、产生自然的 交替运动模式：振动过程中人体姿势被动处于轻微不平衡状态，患者必须积极 主动调节姿势维持身体平衡，进而使患者骨盆产生一个交替的上下晃动运动训 练。骨盆的这种交替的上下晃动运动模式是人体行走和跑动的动作基础，因此 复合振动给人体提供了一个符合人体解剖学特点的训练刺激；2 、复合振动时人 体反复地姿态调节维持身体平衡，增大了肌肉的收缩力度，强化了神经一
6、肌肉 系统的参与并加大了对骨组织的力学刺激，在一定程度上加强了人体的平衡能 力训练；3 、复合振动是在垂直振动基础之上，增强神经肌肉系统在振动过程中 的参与，更强调神经肌肉系统在防治O P 中的作用。课题组早期得出的研究结果 主要有：1 、振动频率对成骨细胞细胞周期、增殖能力、碱性磷酸酶活性均有影 响，实验研究表明振动促进成骨细胞增殖及分化的适宜频率为1 5 4 5 H z ；2 、一 定的复合振动可以增加去势大鼠的骨密度，改善骨微结构、提高骨强度；3 、复 合振动在改善骨质量的同时还可在一定程度上预防或改善肌萎缩，维持或增强 肌力，减轻或改善外周末梢神经功能退变，可能有助于改善或增强平衡能力
7、。 虽然复合振动在成骨细胞和动物层次得到很好的成骨效应，但对唯一引起骨吸 收的破骨细胞尚未进行研究。总之，机械振动信号是一个复杂的网络，其具体 的作用机制还需要进一步研究。 骨重建是一个骨组织自我更新的过程：破骨细胞不断吸收旧骨，成骨细胞 则不断形成新骨补充骨吸收部分。当骨骼成熟后，破骨细胞在骨重建过程中维 持骨量稳定发挥重要作用。破骨细胞增多或活性增强，导致骨吸收增加，骨重 塑失衡，导致很多骨骼系统疾病的发生，如：O P ，类风湿性关节炎，转移性骨 肿瘤。破骨细胞来源于造血干细胞单核巨噬细胞系，由多核巨噬细胞组成，主 硕士学位论文 要分布在骨质表面、骨内血管通道周围，具有特殊的骨吸收功能，在
8、人体生理 性骨重建和病理性骨破坏过程中发挥重要作用。因破骨细胞属于终末细胞，不 能分化传代，分离纯化困难，限制了对破骨细胞功能的深入研究。R A W 2 6 4 7 细 胞是小鼠源性破骨细胞前体细胞，来自A b e l s o n 小鼠白血病病毒所致的肿瘤，代 表破骨细胞分化的早期阶段。核因子1 受体活化因子配体( r e c e p t o ra c t i v a t o ro f N F - r , Bl i g a n d ，R A N K L ) R A N K 骨保护素( o s t e o p r o t e g e r i n , O P G ) 调节轴的发现，让 我们对破骨细
9、胞及其骨生理作用的认识更加深入。随着对破骨细胞分化调控机 制的深入认识，R A N K L 在破骨细胞分化、成熟和活化过程中的作用备受关注。 R A N K L 与破骨细胞前体表面上的R A N K 结合为破骨细胞的分化成熟提供了关 键的信号。R A N K L 能诱导R A W 2 6 4 7 细胞向破骨细胞分化，因此R A W 2 6 4 7 细 胞被广泛用于破骨细胞分化研究。 高频低强度复合振动( 1 0 w - m a g n i t u d e ，h i g h - f r e q u e n c yc o m p o u n dv i b r a t i o n , L M H F
10、 C V ) 的成骨效应是否就是成骨细胞效应的结果，还是存在破骨细胞效应的 成分? 研究振动对破骨细胞分化的影响就能更好地阐述振动防治O P 的机制。因 此，本课题拟使用L M H F C V 直接作用于破骨细胞前体R A W 2 6 4 7 细胞，观察振 动对破骨细胞分化成熟的影响，从而为振动防治O P 机制提供进一步的解释。 目的 1 、观察L M H F C V 对R A N K L 诱导的R A W 2 6 4 7 细胞分化的影响。 2 、探讨L M H F C V 对破骨细胞特异性基因组织蛋白酶K ( c a t h e p s i nK ，C A T K ) 、 基质金属蛋白酶9
11、( m a t r i xm e t a l l o p e p t i d a s e 一9 ，M M P 9 ) 及抗酒石酸酸性磷酸酶 ( t a r t r a t er e s i s t a n ta c i dp h o s p h a t a s e ，T R A P ) 表达的影响。 3 、探讨L M H F C V 对c F o s 蛋白的影响。 方法 1 、L M 唧C V 对R A W 2 6 4 7 细胞分化的影响。 传代细胞以3 x 1 0 3 孔的密度接种于有2 0 0 肛1 完全培养基的9 6 孔板中，第2 天更换为1 0 F B S C S 培养基，R A N
12、K L 组及L M H F C V 组加入1mR A N K L ( 1 0 I - t g m 1 ) ，使其终浓度为5 0 n g m l ，L M H F C V 组加予L M H F C V 刺激( 4 5H z ，0 3 I I I 摘要 g ，1 5 分天，1 次天) ，诱导培养4 d ，每3d 换一次液。诱导培养4d 后，细胞 进行T R A P 染色后进行观察。按试剂盒说明书配制T R A P 染色液，并进行染色， 倒置相差显微镜下观察细胞染色情况、形态及生长状态，并拍照记录。 2 、L M H F C V 对破骨细胞特异性基因C A T K 、M M P 9 及T R A P
13、 表达的影响 传代细胞以1 x 1 0 5 孔的密度接种于有2 m l 完全培养基的6 孔板中，第2 天 更换为1 0 F B S C S 培养基，R A N K L 组及L M H F C V 组加入1 0 1 工lR A N K L ( 1 0 g m i ) ，使其终浓度为5 0 n g m l ，L M H F C V 组加予L M H F C V 刺激( 4 5H z ，O 3 g ，1 5 分天，1 次天) ，共诱导培养3 d 。诱导培养3 d 后，多聚酶链式反应( r e a l t i m e R T - P C R ) 分析破骨细胞特异性基因C A T K 、M M P 9
14、及T R A P 的表达。收集细胞， 用T r i z o l 试剂提取细胞总R N A ，进行总R N A 反转录，最后在A B l 7 5 0 0 P C R 仪 上用S W R * P r e m i xE xT a q 刑试剂盒进行r e a l t i m eR T - P C R 检测C A T K ，M 御9 和T R A Pm R N A 表达，以甘油醛- 3 一磷酸脱氢酶( g l y c e r a l d e h y d e3 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ，G A P D H ) 为内对照，分析C A T K
15、 ，M M P - 9 和T R A P 基因相对表达 量的变化。 3 、L M H F C V 对c F o s 蛋白表达的影响。 传代细胞以l x l 0 5 孔的密度接种于直径3 5 c m 的培养皿，培养液定量为2 m l ， 第2 天更换为1 0 F B S C S 培养基，R A N K L 组及L M H F C V 组加入1 0 p , 1R A N K L ( 1 0 p , g m 1 ) ，使其终浓度为5 0 n g m l ，L M H F C V 组加予L M H F C V 刺激( 4 5H z ，O 3 g ，1 5 分天，1 次天) ，共诱导培养3 d 。诱导培
16、养3 d 后，收集细胞，提取细胞 总蛋白，免疫印迹法( w e s t e r nb l o t ) 检测c F o s 蛋白表达，以G A P D H 为内对照， 分析c F o s 相对表达量的变化。 结果 1 、L M H F C V 抑制R A W 2 6 4 7 细胞向破骨细胞分化。 诱导培养4 d 后进行T R A P 染色，对照组未见T R A P 染色阳性多核细胞，而 R A N K L 组明显出现许多T R A P 染色阳性多核细胞( 3 核) ，即破骨细胞( P 0 0 0 1 ) 。但是L M H F C V 组T R A P 染色阳性多核细胞( 2 3 核) 明显较R A N K L 组少( P = 0 0 0 2 ) 。同时还发现L M H F C V 组T R A P 染色阳性多核巨细胞( 1 0 核) I V 硕士学位论文 较R A N K L 组明显减少( P 0 0 0 1 ) 。 2 、L M H F C V 抑制破骨细胞特异性基因
