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1、L032 CO2-乙醇乙醇-水等电沉淀体系在蚓激酶纯化中的应用水等电沉淀体系在蚓激酶纯化中的应用 齐祥明1,2 关怡新1 姚善泾1 * (1浙江大学化学工程与生物工程学系，浙江 杭州 310027；2中国海洋大学生命科学与技术学部食品工程 系，山东 青岛 266003) 摘摘 要要 以加压CO2为挥发性酸，乙醇为助沉淀剂，对蚓激酶粗品在加压CO2-乙醇-水体系中的 沉淀情况进行了研究，采用本方法可以将蚓激酶粗品中的杂蛋白沉淀出来，实现蚓激酶粗品的 分离提纯。实验结果表明，加压CO2改变了溶液的pH，主要起到酸化剂的作用，该沉淀过程是 一个以等电沉淀为主的过程。乙醇一方面起到助沉淀的作用，另一方
2、面可以使杂蛋白在较高pH 处沉淀出来。酶浓度较高的溶液中酶的稳定性相对较高，沉淀现象亦较明显。实验所考察的操 作范围为乙醇浓度 0%、30%；酶浓度 1%、2.5%、5%；CO2压力 08MPa。在此范围内，蚓激 酶基本能保持稳定，相对酶活在 80%以上。对蚓激酶进行分离提纯的最佳条件是酶浓度 5%、 乙醇浓度 30%，压力 8MPa。这些结果对该方法的进一步完善及其在蛋白质等生物活性成分分 离纯化领域的应用具有借鉴作用。 关键词关键词 等电沉淀 乙醇 加压CO2 蚓激酶 PURIFICATION OF LUMBROKINASE USING COMPRESSED CARBON DIOXIDE-
3、ETHANOL AQUEOUS SYSTEM QI Xiang-Ming1,2 , GUAN Yi-Xin1 and YAO Shan-Jing1 （1 Department of Chemical and Biochemical Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027; 2Department of Food Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003） Abstract The purification of crude lumbrokinase in compre
4、ssed carbon dioxide-ethanol aqueous system was carried out using ethanol as precipitation assistant and CO2 as a volatile acid. As shown in experiments, impurities in crude lumbrokinase solution were precipitated using this technique, the purification of crude lumbrokinase in supernatant could be ac
5、hieved. As compressed CO2 changed pH of the solution, the compressed CO2 mainly serves as acidifier in the precipitation, and the precipitation is a process where isoelectric precipitation plays the main role. The results of experiments operated varying enzyme concentration demonstrated that the enz
6、yme was more stable in the solution with higher enzyme concentration, and precipitation phenomenon is more evident. The lumbrokinase remained stable and the relative activity was over 80% in the investigated range of the experiments, that is, ethanol concentration of 0%, 30%, enzyme concentration of
7、 1%, 2.5%, 5% and CO2 pressure from 0 to 8 MPa. The optimized conditions of crude lumbrokinase purification are ethanol concentration 30%, enzyme concentration 5% and CO2 pressure 8 MPa. The results will be helpful for the further development of protein separation and purification techniques. Keywor
8、ds isoelectric precipitation, ethanol, compressed carbon dioxide, lumbrokinase 引 言 *联系人 联系人：姚善泾. 第一作者第一作者：齐祥明，男，27 岁，博士 超临界CO2抗溶剂沉淀法用于从有机溶剂中沉淀分离蛋白质， 显示了以CO2为沉淀剂的 优点1，而后2又开始转向以CO2为沉淀剂从水体系（或类似水体系）中沉淀分离蛋白质。 Tomasula等35和Hofland等67用CO2从牛奶中沉淀酪蛋白及从水溶液中沉淀大豆蛋白的工 作，提出了用加压CO2作为挥发性酸从水溶液中等电沉淀蛋白质的思路，近年来受到了极 大的关注。
9、但是该方法也有一定的局限性，由于是水溶液，一些水溶解性较好的蛋白质即 使在等电点附近也难以沉淀出来，而且从Hofland等7所报道的数据来看，蛋白质本身也具 有缓冲性质，当其浓度增高时，CO2对体系pH值的调节能力会下降，甚至达不到其等电点。 本文将针对前面工作中的一些不足，提出加压CO2-乙醇-水体系沉淀蛋白质技术，拟以 蚓激酶粗品为研究对象，探索该方法用于活性蛋白质的提取和分离的可行性。 1 材料与方法 1.1 实验材料实验材料 蚓激酶粗品购自无锡金昌生物工程公司，该粗品提取自赤子爱胜蚓。纤维蛋白酶原 （Fibrinogen）购自 Sigma 公司；凝血酶（Thrombin）为杭康生物药业
10、公司生产；尿激酶为 苏州新宝制药厂生产。实验用水为去离子水。其余试剂均系市售分析纯。 1.2 实验仪器实验仪器 高压CO2沉淀设备由本实验室自行设计，参见8。实验前先通入加压CO2，吹扫管路 和釜内洗涤时残留的水，并赶出釜内的残余空气。高压釜充分预热后，向釜内加样 30ml。 然后将预热过的加压CO2从釜内试样液面以下通入。达到所需操作压力后，将釜密闭，保 持 0.5h。对蚓激酶溶液所进行的分离实验，其实验结果是通过分析滤液获得的，采用高压 在线过滤过程，取得过滤所得清液。分别分析滤液的酶活和蛋白质含量，每组实验重复 3 次，取平均值。UV-9100 型紫外光栅分光光度计由北京瑞利分析仪器公司
11、生产。pH测量计 为pHS25 数显酸度计，由上海精密科学仪器有限公司生产。SORVALL Super T21 冷冻离 心机购自美国Dupont公司。 1.3 分析方法分析方法 于 550nm 处测定透光率，以考察溶液中蛋白质沉淀情况。设定初始蛋白质溶液透光率 为 100%，作为空白对照，溶液浊度以相对透光率表示。 2 实验部分 2.1 蛋白质溶液的配制 2.1 蛋白质溶液的配制 原料液：称取一定量的粗酶，按质量比配制成水溶液，搅拌至完全溶解，4 oC保存备用。 实验样品：称取原料液若干，按比例配入水和乙醇。本实验所配溶液中粗酶制品含量， 未经特别注明，均为 1%（wt） 。溶液原始 pH 值
12、未注明均为 67。乙醇的用量不超过 30。 2.2 沉淀过程沉淀过程 将温度调至设定值 35，将溶液加入沉淀釜。温度恒定后缓慢充入CO2，使压力升高 至实验要求值。保持一段时间，在线或取样分析。 2.3 釜内溶液釜内溶液 pH 值的测定值的测定 采用酸碱指示剂法对釜内pH值进行测定，详细操作参见文献8。 2.4 蚓激酶酶活测试方法蚓激酶酶活测试方法 采用尿激酶纤维蛋白平板法9, 10对蚓激酶溶栓总活力进行测试。参照标准曲线的绘制 方法，取 10L测液以同样的操作步骤进行。最后量取溶圈面积，通过标准曲线求得待测酶 液的酶活。将未处理酶液的酶活设定为 100%，作为对照，以相对酶活表示处理后酶液酶
13、 活。 3 结果与讨论 3.1 釜外酸化溶液所得沉淀情况釜外酸化溶液所得沉淀情况 前期的实验结果表明，加压CO2在蛋白质沉淀过程中主要起到酸化溶液的作用。而釜 内、釜外对比实验更表明，两者酸化所得沉淀结果极为吻合。因而，针对蚓激酶溶液，先 在釜外采用盐酸酸化，考察溶液的沉淀情况和酶活变化情况。从各pH值溶液（含有沉淀） 中取样进行相对酶活的测定，然后再将各pH值的酶液在 25、8000rpm下离心半小时，测 其相对酶活及蛋白质含量。图 1 示出了 5%粗酶水溶液所得实验结果。从中可以看出，当 溶液pH低于 5 时，有蛋白沉淀生成，但不是蚓激酶。在pH高于 3.5 时溶液中的蚓激酶活性 可以保持
14、在 90%以上，把pH降低到 3.0 时溶液中蚓激酶迅速失活。综合这些结果可知：将 溶液pH调节至 3.55.0 范围内，可以实现蚓激酶的除杂。 釜外实验进一步考察了乙醇加入后对于沉淀过程的影响。结果表明，乙醇可以起到促 进沉淀的作用，在 pH4.5 沉淀现象就已经相当明显（对于无醇溶液，需要 pH 为 3.5 才能达 到同样的沉淀效果） 。此外，对滤液的酶活测试显示，滤液中蚓激酶相对酶活均在 85%以 上。由此表明，乙醇含量为 30%时，在涉及的 pH 范围内蚓激酶仍保持可溶状态；30%的 乙醇在实验条件下对于蚓激酶活性的影响不大。 34567 0 20 40 60 80 100 Fract
15、ion of protein in supernatant Relative activity (%) pH protein remaining soluble relative activity in suspension relative activity in supernatant 02468 4 5 6 7 Fraction (%) pH Pressure of CO2 (MPa) curve of pH 0 20 40 60 80 100 fraction of protein in filtrate 02468 4 5 6 7 Fraction (%) pH Pressure o
16、f CO2 (MPa) curve of pH 0 20 40 60 80 100 fraction of protein in filtrate Fig.1 Relative activity and protein fraction in suspension and supernatant acidifying with HCl Fig.2 pH and protein fraction in filtrate （5% enzyme, no ethanol） Fig.3 pH and protein fraction in filtrate （5% enzyme, 30% ethanol） 上面的工作表明，在pH3.55.0 内可以实现提纯，用加压CO2使酶溶液酸化至这一范围 的可能性是存在的。为此，首先考察了粗酶含量为 5%的水溶液用加压
