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1、用“ C a 示踪在石棉作用 下胞浆内C 扩 + 浓度变化的来源 岳东方 匕 京师范大学， 2釜克 君之何明2武绍勇2姜山2赵晓 红梁 前进 北京， 1 0 0 8 7 5 : 2 . 中国原子能科学研究院， 北京, 1 0 2 4 1 3 ; 3 . 北京医 科大 学公共卫生学院， 北京.1 0 0 0 8 3 一、探讨项日 提出和研究目的及意义 钙是人体的一种重要元素。人体的骨骼中就含有大量的钙质.早期研究表明， 钙在肌肉 收缩、激素、消化酶类和神经递质的释放中起着重要的作用;近期研究发现，钙参与更广泛 的生理过程。 如细胞膜的 通透性及细胞兴奋性的控制、细胞代谢、细胞形态的维持、 细胞周
2、 期 的调 控以 及生 殖细胞的 成熟和受精 等。 它 在这些 生理过程中 主要 起到第二信使的作 用。 3 ,5 ,6 ,7 1 石棉是一组矿物纤维的总 称，由 于石棉具有隔热、绝缘和耐磨等多种优良 特性， 使其开 发使用面很广。石棉污染不仅仅局限于工作环境， 也己 扩展到生活的大气环境。 有关石棉致 癌机理国内 外己 作了 大量工作。I A R C早在7 0 年代就已 将石棉列为人类的致癌物之一。 4 1 早 在 1 9 8 9 年， R o n e y 等 人将石棉与A M孵 育后发 现， ( 此石 棉为非 细胞毒 性剂量2 .5 - 2 5 u g / n il ) 发 现 胞 浆C
3、a t 浓 度 迅 速 升 高， 然 后C a t 十 浓 度 迅 速下降 到 一 个比 刺 激 前C a 浓 度 略 高 的 水 平。 110 1 1 9 9 0 年，K a l l a 等 报 道， 当 把 石 棉 跟A M孵 育 发 现了 上 述的C 扩 + 浓 度 变 化。1 19 0 年 代中 期， 北医公卫 学院 的 王 起恩等 人用大剂 量的 石棉 刺激细胞 ( 5 0 - 4 0 0 11 g / m l ) 发 现， 石棉 对 细 胞钙浓 度有剂量时间 效 应. 1 ,2 .4 1 又因 为 石棉 致癌的 一 方面原因是通 过产生 活性 氧等 物 质 间 接作用于靶细胞。 活
4、性氧包括O H , 0 2 - , H 2 0 2 等。 王红等发现将H 2 O : 与P C 1 2 细胞孵育时使 胞 浆内 的C a t 浓 度随 时 间 呈 直 线 样 升 高， 且 有 剂 量 反 应效 应。 I 在生物学上，要查明钙离子的来源可以 通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜配合使用各 种钙通道的阻断剂、 拮抗剂来解决问 题。 但其过程复杂，费用昂 贵。同位素示踪也是解决来 源问题的一种好的方法。 钙有六种稳定同位素，4 0 C a ( 9 6 .9 4 % ) , 4 2 C a ( 0 .6 4 7 % ) , 4 C a ( 0 . 1 3 5 % ) .4 4C a (
5、2 .0 8 6 % ) C a ( 0 .0 0 4 % ) 和 0 C a ( 0 . 1 8 7 % ) e 这些稳定同 位素都 是在自 然界中 存在， 因而 也存在于 生 物体中， 因 此它们都不适合于 作为 生物体内的 示踪剂。 钙有三种放射性同 位素， 4 1 C a ( 半衰期I .0 X 1 0 5 ) , C a ( 0 衰 变， 半衰期1 6 5 天) ， C a ( S 衰变， 半 衰期4 .5 幻， 后两者由 于半衰期 短， 不 适 合 作钙的长期代谢观察研究， 此外它们的 辐射必然对生物体的细胞产生损伤，也不适合做生物 体内 的 示踪 剂。 4 C a 为 理 想的
6、生物医 学示 踪剂。 但是由 于半 衰期 长和X射线能 量 低， 采 用衰 减 记 数方 法难以 实 现 对它的高 灵 敏测量。 另 外， 由 于4 C a 的同 量异 位素4 1 K 的 干扰和 分子4 C a H 的 干 扰， 采用传统的 质谱方法也不能实现对其测量。 A M S 方法因为具有排除同 量异位素 本底 和分子本底干扰的能力， 将成为测量4 1 C a 的 理想方法。 这个项目 是由 我们中国原子能科学研究院的核物理所和北京大学医学部的公共卫生学院 合作，旨 在查明游离 钙离 子浓度的升高在石棉致癌的过程起的作用，查明钙离子的来源， 究 竞是来自 胞外，还是来自 胞内钙库，内
7、质网?或线粒体?希望能够为石棉的致癌机理提供一 些基本数据. 这一 项目 的的意义就在于，一方面可以为生物学领域钙离子的测量提供一种新的测量手 段，为石棉致癌机理提供一些基本数据，另外一方面就可以促进学科间的合作和交流。这也 是国际上首次将人 ms 技术应用于细胞生物学领域。 二、研究内容 我 们实 验的目 的 就是 探讨 在大剂 2石棉 刺激下细胞引 起胞 浆C a t + 浓 度的 升高， 其C a t 来 源， 究竞是胞外， 胞内 ( 线粒体还是内 质网) ， 还是二者同时.由 于石棉主要是被人吸入从而 引 起肺纤维化、 肺癌、 脚膜间皮瘤等病症， 所以我们用肺的成纤维细胞为研究对象 3
8、 1 . ( 一 ) 应 用 激 光 共 聚 焦 技 术 ， 配 合 使 用 各 种 钙 通 道的 阻 断 剂、 拮 抗 剂 对C a = 浓 度 的 夔 化 的 来 源进行探讨。 ( 二) 、 用A M S 方 法对c e浓度的 变化的来 源进行 探讨. A M S 是二 十 世纪 七十 年代 末发 展起来的 一 种核分析 技术， 它是 在传统质谱 分析方 法的 基 础上再结合核物理实脸所用的加速器和离子鉴别手段， 有效排除了 各种本底干扰， 直接对原 子进行探侧。它具有高灵徽度， 且侧A 所需样品 a少的 优点 1 3 1 ( 1 ) 基本数据 A每 个 培 养 瓶中 有l o n il培
9、 养 液， 含 有5 x 1 夕 个 细 胞. 约 为5 x 1 0 6/ m l . 每 十 个 培 养 瓶 中的 细胞能 提 取的 胞浆约为0 .2 m 1 ,胞桨C a 浓度约为4 0 0 n m o U l。 可以 据此算出 每 个 细 胞 胞 浆 中 的C a 原 子 数 . B 正 常 细 胞 胞 桨C a l 浓 度 约 为4 0 0 m n o l/ l ， 即1 6 u g / 1 , 线粒 体和内 质网的C a + 浓度约 在1 .8 m m o lA ， 约 含有的C a 原子 数可以 通过A A S 侧 I( 国 家 标物中 心可以 侧2 到n g / m l ) .
10、细 胞经分步离 心， 提取 各部分， 再 经高 沮消 化后定容，进行 A A S Nit . B . C . 示 踪 剂 为C a C 0 3 ( 示 踪 时 要 转 化 为C a C I 4 淇中 的41 C a /4 0 C a = 4 .3 x 1 0 一 这 一 数 据 是 通 过 表 面电 离 质 谱 测 得 . 这 样l m g C a O中 含 有8 x 1 0 1 个4 1 C a 原 子 . C . ( 2 ) . 荃本计算 假 设1 0 m 1 培 养 液 中 加 入l m g C a C 0 3 ( 含 有4 1 C a ) ,再 假 设 有 外 界 刺 激 存 在， 每
11、 个 细 胞 中 有1 0 个C a 进 入， 这 样 共 有5 % W,假 设l 0 , 个c : 进 入1 0 m l 的 细 胞中 ， 则 至 少 有2 x l 0 个4 1 C a 进入l o m l 细 胞， 我们做 一个 样品 需 要1 0 瓶细胞， 这 样每个 样品中 含4 1 c为2 x 1 0 . 个. 根据 A M S 测 A 灵 敏 度 C a / o C a = 1 0 0 如 果 将 来 每 个 样 品 中 加 入1 0 m g C a O 做 载 体， 则 耐C a p O .O l x 6 .0 2 X 1 0 z X l O - / 5 6 X 1 0 原 子
12、. 我 在 侧 量 时 希 望 在 样 品 中 有l 0 - 1 0 9 个 C a 原 子， 又由 于 培 养 液中 本 来 就 含 有， 0 C a c L 1 加 入的 载 体C a 0后， a c 。 会 进一 步 被 稀 释， 又 可 能 进 入 细 胞中 的C a 要 大 于1 0 4 . 这 只 是 估 计 情 况， 要 做 培 养液中C a t 浓 度 梯 度 实 验， 看C a t 浓度为何时， 细胞长的最好，为 何时， 细胞死亡，再选择适当 浓度进行细胞培养， 选择加入 适 当 量 示 踪 剂 . 示 踪 剂C a C O 3 ( 含 C a )加 入 之 前 要 用H C
13、 L处 理， 调 到 与 培 养 液同曲值 时 才可以 加入。) 这 部 分 工 作 已 于 去 年 年 底 完 成， 最 适 的C a + 浓 度 约 为0 .6 m g / m l , 刺 激 物 石 棉 的 浓 度 为 2 0 0 n g h n i . ( 3 ) . 示踪方法 实 验材料为人肺细胞H L F ， 培养液为1 6 4 0 滋痛物为石棉。 B . 将细胞分为四部分. 第一组， 示踪前的对照组，为正常细胞不受刺滋时细胞内各部分的浓度，十瓶细胞，分 别 提取 其线 粒体，内 质网 和细胞 胞浆， 分 别用A A S 侧其C a 浓 度， 并 对培 养液做n C a / 0 C
14、 a 的 A MS 侧f. 第 二组， 为 对比 组， 流 程空白 . 为 正常 培养 液中 加 入刺滋 物石棉再加入i o m g c a c 0 3 ( 该C a O 不 含 C a ) ， 分 别 提 取 各 部 分 ， A A S 侧 Ac e浓 度. 要 在1 小 时 ， 8 小 时 ， 2 4 小 时 分 时 取 样 . 对培 养液做a C a / o C a 的A M S M IK 第 三 组 ， C 。 示 踪 组 ， 为 实 验 组 ， 分 时 取 样. 除 了 加 入 的C a c o ， 其 中 含 有4 1 C 。 外 ， 都 与 二组相同。 所取样品都要加载体后， 进
15、行A MS 侧I。 这样进行A MS 侧It 的 样品共有1 1 个。 第四 组， 染 毒 对照， 不用 加石棉 刺 橄细胞， 只 在培 养液中 加入 0 C a C h ,A A S MIR 各 部 分 的C a 2 , 浓 度。 分时 取样 . 分组I A A S 测量样IV A M S 测量 样品 空白组线粒体，内质网和细胞胞浆 ( 共 3 个) 培养液 ( 1 个) 对比 组 ( + 石棉+ C a )一 分时取样 同 上 ( 共9 个) 同 上 .I ca示踪组 (+石棉 护 C线粒体，内质网和细胞胞浆 ( 共9 个) 染毒对照 ( 十 C a )分时取样 线粒体，内 质网和 细胞胞
16、浆 ( 共9 个) 将样 品 放在增塌内 ， 在每个样品 中 加入5 m g 的C a O , 8 0 0马 福 炉烧2 小 时. 样品取出后用硝酸溶解。 加 入 浓氨 水调 溶液灿至1 0 ,然后 加入草酸 胺， 沉淀钙离 子. D o w e x -4 0 0 树脂预先用蒸馏水泡2 4 小时， 装柱7 c m高，先用0 .0 8 M的硝酸预先处理树脂， 再用4 M硝酸处理树脂，蒸馏水冲洗至中性。 。 将沉 淀用硝酸溶解，调p h 至中性， 上样。 先 用。 .0 8 M的硝酸处理树脂， 也可以 将一些与树脂吸附能力弱的离子祛除. 再用4 M硝酸处 理树脂，这时洗下的为钙离子，收集液体。蒸馏水冲洗树脂至中性。 . 将
