《猪链球菌流行病学及其生物被膜形成机理研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《猪链球菌流行病学及其生物被膜形成机理研究（118页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分类号 猪链球菌流行病学及其生物被膜形成 机理研究 S t u d yo nt h ee p i d e m i o l o g yo fS t r e p t o c o c c u s s u i sa n dt h em e r c h a n i s mo f t h e i rb i o f i l mf o r m a t i o n 博士研究生：魏子贡 指导教师：金梅林教授 指导小组：陈焕春院士 何启盖教授 周锐教授 郭爱珍教授 吴斌教授 专业：预防兽医学 获得学位名称：农学博士 研究方向：动物病原微生物学 获得学位时间：2 0 1 0 年月 华中农业大学动物科技学院动物医学院
2、二。一。年六月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权二慨 学位论文 是否保密 卺 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究蚴：主勉士毳 帆加年月7 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提
3、交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：吾恕士灵导师签名： 触 签名日期珈细年6 月f 7 日 签名日期别啤6 月夕日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 摘要 A b s t r a 缩略词 第一章 1 1 1 1 3 核酸质谱
4、M L S T 分型5 1 2 猪链球菌弱毒苗7 1 2 1 猪链球菌天然弱毒疫苗7 1 2 2 猪链球菌基因突变弱毒疫苗7 1 3 细菌生物被膜和猪链球菌新的毒力相关因子9 1 3 1 细菌生物被膜9 1 3 1 猪链球菌新的毒力相关因子1 l 第二章猪链球菌流行病学1 3 2 1 前言1 3 2 2 材料与方法。1 4 2 2 1 细菌分离和鉴定1 4 2 2 2 猪源链球菌分群分析和猪链球菌鉴定1 5 2 2 3 猪链球菌血清型和基因型的鉴定1 5 2 2 4 对2 型猪链球菌的生物被膜进行鉴定1 5 2 2 5 对猪2 型链球菌的代表菌株测定其对小鼠的毒力16 2 2 6 药敏试验方法
5、1 6 2 2 7 检测四环素相关抗性基因1 6 2 2 8 测定分析t e t O 序列1 6 2 2 9M L S T 分析菌株1 6 2 2 1 0 提取基因组D N A 1 6 2 2 1 1P C R 扩增及测序1 7 2 2 1 2M L S T 数据分析1 7 2 2 1 3 不同序列型的代表菌株对健康猪外周血抵抗能力的差异1 8 2 2 1 4 通过M A L D I T O FM S 进行M L S T 分型1 8 2 2 15 数据统计分析1 9 2 3 结果2 1 华中农业大学博上学位论文 2 3 1 菌株分离和鉴定2 1 2 3 2 猪链球菌的血清型和基因型鉴定：2 l
6、 2 3 32 型猪链球菌菌株特征和毒力之间的关系2 4 2 3 4 四环素抗性测定与抗性基因检测2 6 2 3 5M L S T 分型结果2 6 2 3 6 不同序列型的代表菌株对健康猪外周血抵抗能力3 4 2 3 7 疾病爆发相关信息3 4 2 3 8 用M A L D I T O FM S 对分离菌株进行M L S T 分型3 7 2 4 讨论3 7 第三章生物被膜形成菌株初步应用4 4 3 1 前言4 4 3 2 材料与方法4 5 3 2 1 天然弱毒株选取4 5 3 2 2 天然弱毒株安全性试验4 5 3 2 3 天然弱毒株免疫后抗体检测及攻毒保护4 6 3 2 3 天然菌株突变致弱
7、相关引物及载体4 6 3 2 4 突变株构建4 9 3 2 5 突变株生长特性。4 9 3 2 6 弱毒苗免疫及攻毒保护试验4 9 3 2 7A u t o l y s i n 诱导表达纯化及w e s t e m 验证5 0 3 2 8E L I S A 分析A u t o l y s i n 区分灭活苗血清和弱毒苗血清的能力5 0 3 3 结果51 3 3 1 天然弱毒株仔猪安全测试结果5 l 3 3 2 天然弱毒株免疫抗体检测与攻毒保护结果5l 3 3 3 载体与突变株的构建5 2 3 3 4 突变株的生长特性5 3 3 3 5 构建的弱毒缺失突变株对猪的安全性5 3 3 3 6 突变株
8、疫苗的抗体产生规律5 4 3 3 7 突变株疫苗攻毒保护效果5 4 3 3 8 突变株疫苗攻毒保护病理分析5 5 3 3 9A u t o l y s i n 表达，w e s t e m 验证及区分灭活苗血清和弱毒苗血清的能力 ! ；7 3 4 讨论一5 8 第四章生物被膜形成能力机制初步探讨及新的毒力相关基因发掘 6 1 4 1 前言。6 l 4 2 材料与方法 4 2 1 菌株，培养基，引物，载体6 3 4 2 。2 猪链球菌全基因组表达谱芯片的设计与制备6 4 4 2 3c D N A 第一链和第二链“一步法”合成6 4 4 2 4c R N A 合成及标记6 5 4 2 5c R N
9、 A 样品片段化和芯片杂交6 6 4 2 6 芯片结果分析6 6 4 2 7R e a l t i m eP C R 验证相关基因的上调表达6 6 4 2 8S Y B RG r e e n 实时定量P C R 6 7 4 2 9 相对m R N A 表达水平的计算。6 7 4 2 1 0 相关基因突变对菌株生物被膜形成能力的影响6 8 4 2 1 1 相关基因的突变株对小鼠毒力测定6 8 4 2 1 2 细菌侵袭细胞实验6 9 4 2 1 3 细菌粘附细胞实验：6 9 4 2 1 4 细胞毒性实验6 9 4 2 1 5 相关基因缺失突变株对抗猪外周血吞噬能力。7 0 4 3 结果7 0 4
10、3 1F i b r i n o g e n 诱导猪链球菌转录水平的变化7 0 4 3 2l e u D 和a u t o l y s i n 上调表达定量P C R 验证7 2 4 3 3 突变株构建及验证7 3 4 3 4 相关基因缺失突变株及对应的回复突变菌株对生物被膜形成能力的影 响7 6 4 3 5 相关基因缺失突变株及对应的回复突变菌株对H e p 2 细胞的黏附侵袭 能力差异7 7 4 3 6 相关基因缺失突变株及其对应的回复突变菌株对H e p 2 细胞及S J P L C 细胞毒性差异7 8 4 3 7 相关基因缺失突变株及对应的回复突变菌株对B A L B c 小鼠毒力的差 异j 7 9 4 3 8 相关基因缺失突变株及对应回复突变株抵抗猪外周血吞噬能力的差异
