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1、中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会 小鼠免疫试验：将纯化蛋白与适量佐剂乳化成油包水液，免疫小鼠，每只皮下分点注射 抗原5 0 u g ，免疫前l 天、免疫后7 天、1 3 天分别断尾采血，收集血清；1 4 天时进行二免， 二免后5 、1 0 天分别采血收集血清。 血清抗体检测：用纯化的抗原蛋白包被E L I s A 板，检测血清抗体：分别以H 1 N l 、H 3 N 2 病毒做抗原，血凝抑制试验检测血清抗体。 2 结果 根据合成基因序列，体外扩增。获得了与预期大小一致的3 0 0 b 口的基因片段，该片段经 双酶切，连接到P E T 3 0 ( a ) 载体，P C R 鉴定
2、，成功获得了含有外源目的基因的重组质粒。 利用I P T G 诱导表达获得了分子量为1 9 k d 的蛋白带，在菌体浓度O D 值为O ，6 O 8 ， I P T G 终浓度O 。O l m M ，诱导4 - 5 h 表达蛋白量最高， 表达蛋白的纯化：该表达载体含有H i s t a g 多肽，采用亲合层析方法在变性条件下洗脱， 获得了较好纯化效果。 w 防c e mB l o t 检测，该表达蛋白可与抗H i s I t a g 、抗H 1 N 1 和H 3 N 2 亚型s I V 高免血清发 生免疫学反应，产生特异性反应带。 小鼠免疫试验。二免后，E L I s A 检测针对免疫蛋白抗原
3、，试验组血清O D 值显著高于对 照组。且能抑制s H 1 N l 、H 3 N 2 与红细胞的血凝反应。 3 结论与讨论 研究成功构建表达了含有S I v H l N l 、H 3 N 2 亚型H A 、N A 蛋白抗原表位模拟蛋白，且 表达蛋白具有与H 1 N l 、m N 2 亚型阳性血清发生免疫学反应的生物学特性，表明该表达蛋 白具有S I v 病毒的免疫原性和反应原性。构建的串联表位，包含了来源于S I vH 1 N l 、H 3 N 2 H A 基因的T 、B 表位抗原，可同时诱导机体T 、B 淋巴细胞反应具备理想疫苗的特性。 小鼠免疫2 次后试验组血清抗体显著高于阴性对照组，而细
4、胞免疫学指标正在检测中。 以重组表位抗原作为新型疫苗研制，一方面可避免采用全病毒基因片段而出现的重组、 整合等问题安全性好；另一方面出于抗原片段短，可将来源于不周病原、不周基因的表位 串联表达，研制多价疫苗；而且还可以通过串联多拷贝基因达到提高免疫效果的目的。因此 近年来表位疫苗研究倍受关注由于动物流感病毒基因组高度变异，重组几率高的特点，传 统疫苗潜在危险均很大表位痘苗则是动物流感病毒疫苗研究的新方向。 参考文献路 猪源H 9 N 2 亚型流感病毒H A 基因的序列测定及真核表达 韩庆功u 乔传玲扬焕良1 。陈艳1 。辛晓先。，丁选亚1 陈化兰” ( 1 中田农业科学院哈尔滨善医研究所善医生
5、物技术困末重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈 尔滨黑龙江1 5 0 0 0 l2 河南科技学院动物科学学院新乡河南4 5 3 0 0 3 ) 擅蔓z 利用R 1 坤c R 扩增猪流感病毒躺w i n e 勘d j 鲫g ，7 彪0 0 H 9 N 2 ) H A 基因，剥序后将箕克隆到真棱 表迭靓体p c A G G s 上经酶切分析，P c R 茔定和测序验证，得到重组表达质杜p c A O G s - H A ，之后将其转 粢2 9 3 T 细胞，4 8 h 后收集转象细胞样品进行s D s P A G E 分析，蛄果显示H A 蛋白荻得了表速经w e 蹴m - b l o t 检测
6、蛄果表明p c G - 姒能够在体外瞬时表达具有免疫擘活性的H A 蛋白，通过免疫小鼠，对其免疫效 果进行7 初步研究 关键词；猪流感病毒；H A 基因：序列测定；真棱表选 猪流感( s w i n eI n n u e n 殖，S I ) 是由正粘病毒科流感病毒引起的种急性、高度接触传染性 的猪呼吸道疾病。临床以突发、高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭、高发病率、低死亡率为特征， 单纯s I 的病理变化主要表现为病毒性肺炎及其它呼吸器官的炎性变化，但有其它痛原继发 或混合感染时病理变化会严重而复杂川。 猪的传染病 H 9 N 2 亚型流感病毒为低致病性流感病毒，目前流行于世界各地，其不仅给养禽业带来
7、 严重威胁，而且还可以感染猪及人类口。J ，同时还是引起9 7 年香港流感的H 5 N l 亚型禽流感 病毒的内部基因的供体【4J ，因此，对H 9 N 2 亚型流感病毒研究近几年倍受世界流感研究工作 者的关注。M a r k w e l l 等在1 9 9 8 年4 月。从香港的家猪体内分离到了两株H 9 N 2 流感病毒， 这是首次从哺乳动物体内分离到H 9 N 2 亚型的流感病毒，之后在多次的全国流感流行病学调 查中，又从不同省、市分离出多株H 9 N 2 亚型流感病毒，说明近几年H 9 N 2 亚型流感病毒已 经成为中国大陆猪群中重要的流行毒株。本研究对一株猪源H 9 N 2 亚型流感
8、病毒 A ，S w i n e 酯e j i a n g ，7 ，2 0 0 4 m 9 N 2 ) 的H A 基因进行了序列测定，并构建其真核表达载体，进 而检测了H A 蛋白在体外的表达情况及免疫效果。 l 材料与方法 1 1 病毒 猪流感病毒A ，S w i n e z h e j i 卯佗0 0 4 ( H 外屹) 是采集健康猪鼻腔棉拭子，按常规方法进行 流感病毒的分离、鉴定而获得。经S P F 鸡胚增殖、纯化后，7 0 0 c 保存备用。 1 2 试剂、酶硬质粒 R N A 提取试剂T r i z o I 、M M L V 反转录酶、E x 嘲D N A 聚合酶、d N r P 、T
9、 4D N A 连接 酶、P 仍1 8T 载体、D L 2 0 0 0 D N Am a r k e r 及各种限制性内切酶均购白宝生物工程( 大连) 有限公司；H 9 亚型禽流感多克隆血清由国家禽流感参考实验室提供，碱性磷酸酶标记的羊 抗鸡k G ，购自S i g m a 公司：p c A G G S 质粒含鸡争t i n 启动子和C M V 增强子由哈尔滨兽 医研究所步志高研究员提供。 1 3 引物 根据G c n B k 中H 9 N 2 亚型流感病毒H A 基因的序列，利用O 9 06 软件设计引物，l 引物：U n i l 2 ：5 - A G C A A A A G C A G G
10、 - 3 ，P C R 上游引物：5 A G CA A AA G CA G GG G AA T T T c A c3 ；下游引物：5 从G G G G T G T r l l r l G c c 从T 1 A T 3 ，均由上海英骏生物技术 有限公司合成。 1 4 姒基因的R T P c R _ 及序列测定 应用T R I z 0 IR e a g e n t 提取病毒R N A ，按盯P C R 常规方法扩增H A 基因，电泳回收、 纯化目的片段，采用双脱氧链终止法在B e c k m c E 0 8 0 0 0 测序仪( B e c k m ，A m e r i c a ) 上 进行测序，
11、之后利用D 悄A s T A R 软件( D N A S T A R I n c ) 把得到的序列进行拼接与分析。 1 5I n 基因真核表达鞍体p c A G G s 1 I A 的构建 首先将H A 基因片段克隆到质粒p M 阻1 8T 中，再利用限制性内切酶S I 和s p hI 将 H A 基因从p M D H A 中切下。定向克隆到真核表达载体p C A G G S 中，重组质粒p c A G G S H A 需经进一步的酶切鉴定及P c R 验证其克隆是否正确。 1 6 姒基因的体外表达及检测 按照L i p o f e c t m i n e l 也0 0 0 试剂盒的转染方法将
12、已构建的表达载体p c A G G s H A 转染 2 9 3 T 细胞，用质粒转染后4 8 小时的2 9 3 T 细胞及未转染质粒的细胞裂解后制各的样品进行 S D S - P A G E 。之后用H 9 亚型禽流感多克隆血清进行W b s t c l - b l o t 检测H A 蛋白的表达情况。 1 7p C A G G s - l I A 阳性质粒的大量制备及其纯化 参照J 萨姆布鲁克主编的分子克隆实验指南D N A 疫苗质粒的大量提取方法，对在 体外细胞中良好表达的p C A G G S H A 质粒大量制各，并测定其含量和纯度，然后备用。 1 8 动物免疫试验 1 8 1 B
13、A L B ，C 小鼠 6 - 8 周龄的免疫用B A L B ，c 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。 1 8 2 免疫与攻毒 将3 0 只小鼠随机分为3 组，每组1 0 只，一组接种重组质粒p c A G G S H Al O g ，一组 4 1 6 中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会 接种重组质粒p c A G G s 扎1 0 0 峙，剩余一组接种P B s 溶液作为对照，1 0 0 “l 只，接种方法 均为腿部股四头肌分两点肌肉注射，首次免疫后3 周l ；l 同样免疫剂量和途径加强免疫。加强 免疫后2 周，用1 0 6 E I D 5 0 的病毒A ，S w
14、i n 以h c j i a I l g ，7 ，2 0 0 4 ( H 9 N 2 ) 对各组小鼠进行滴鼻感染， 1 0 0 u l ，只。攻毒后每天观察并详细记录小鼠的发病、死亡情况。 1 8 3 血清学抗体测定 小鼠在初次免疫后3 周及加强免疫后2 周均经断尾或心脏采血、分离血清，测定其H I 抗体 1 _ 8 4 病毒滴定 在攻毒后第6 、9 、1 2 天剖杀小鼠，取其肺脏，匀浆后进行病毒滴定。 2 结果 2 1 姒基因的R T - P C R 从猪流感病毒躺、v i n e 自强e j i 盯，2 0 0 4 ( H 9 N 2 ) 感染的S P F 鸡胚尿囊液中提取R N A ，
15、R m R 扩增H A 基因。结果扩增获得的片段其核苷酸长度约为1 7 k b ，与预期扩增片段大 小相符结果见图l 。 2 2I I A 基因的序列测定与分析 利用D N A g t a r 软件完成了H A 基因序列的拼接，通过与G e n B a n k 中H 9 N 2 亚型流感病 毒H A 基因序列同源性比较，结果发现本研究所分离的毒株A ，s w i n e z h e j i a n 卯，2 0 0 4m 9 N 2 ) 其姒基因序列与禽流感病毒伽a i l ，s h 咄，9 6 ，( H 9 N 2 ) H A 基因核苷酸的同源性高达 9 9 4 。 图1 H A 基因的R T
16、 P C R F 嘻l 佩o f H A 雕 1 R T - P C R ho f I A g e n c 2 H 2 0 c o n n 0 1 3 D L 2 0 0 0D N Am a r k 盯 2 3 姒基因真核表达载体的构建 限制性内切酶S a c I 和S p hI 将H A 基因从p M D H A 中切下。定向克隆到真核表达载体 p c A G 0 s 中。重组质粒p C A G G s H A 经酶切鉴定及P C R 鉴定，结果见图2 和图3 ，结果表 明H A 基因己正确克隆到载体p c A G G s 中。 2 4 姒基因的体外表达及检测 收集质粒转染后4 8 小时的2 9 3 T 细胞及未转染质粒的细胞样品，裂解后进行S D S 队G E ， 之后进行w b s t e m - b 1 0 t 检测。结果转染质粒的细胞样品检测到分子量大小约为7
