《烟草脉带花叶病毒侵染性克隆的构建及其在交叉保护、外源蛋白表达及vigs中的应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《烟草脉带花叶病毒侵染性克隆的构建及其在交叉保护、外源蛋白表达及vigs中的应用（102页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、S h a n d o n gA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y P h D DIS SE RT A T IO N C o 一 o ff e c t i oc D N Ac l o n e n s t r U c t i o no ta ni n l e c t i o U SCAc l o n eo t “L0 ，一 ， - - 1 0 D n c c ov e l nD a n d l n gm o s a t cv l r H Sa n di t s U S ef o r c r o s s p r o t e c t i o n ，p
2、r o t e i n o v e r - - e x p r e s s i o na n dV I G S D e p a r t m e n t ：L i f es c i e n c e M a j o r ：M i c r o b i o l o g y P h D C a n d i d a t e ：G a oR U i S u o e r v i s o r ：L 。X i a n gD o n g u o e r v l S 0 r 1 l a n g - o n g J u n e ，2 0 1 2 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，
3、独立进行科学研究 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定， 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术 信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库并向社 会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：I 查星! 垒 导师签名 日期： A
4、 S ：a c e t o s y r i n g o n e ，乙酰丁香酮 符号说明 B C I P ：5 - b r o m o 4 c h l o r o 3 i n d o l y lp h o s p h a t ep - t o l u i d i n es a l t ，5 一溴一4 - 氯3 吲哚磷酸 C I ：c y l i n d r i c a li n c l u s i o np r o t e i n ，圆柱状内涵体蛋白 C P ：c o a tp r o t e i n ，外壳蛋白 D E P C ：d i e t h e l p y r o c a r b o
5、n a t e ，焦碳酸二乙酯 d N T P ：d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ，脱氧核糖核苷三磷酸 E L I S A ：E n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y , 酶联免疫吸附测定 G F P ：g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，绿色荧光蛋白 H C - P r o ：h e l p e rc o m p o n e n t - p r o t e i n a s e
6、，辅助成分一蛋白酶 K a n ：k a n a m y c i n ，卡那霉素 k D a ：k i l o d a l t o n ，千道尔顿 L B ：L u r i a B e r t a n im e d i u m ，L B 培养基 M E S ：2 一( N M o r p h o l i n o ) e t h a n e s u l f o n i ca c i d ，2 - ( N 一吗啉) 乙基磺酸 N B T ：n i t f o t e t r a z o l i u mB l u ec h l o r i d e ，氮蓝四唑 P 3 ：t h et h i r dp
7、 r o t e i n ，第三蛋白 P B S ：p h o s p h a t e b u f f e r e ds o l u t i o n ，磷酸盐缓冲液 P T G S ：p o s tt r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，转录后基因沉默 R A C E ：r a p i da m p l i f i c a t i o no f c D N Ae n d s ，c D N A 末端快速扩增技术 R i f tf i f a m p i c i n ，利福平 S D S ：s o d i u md o d e
8、c y ls u l f a t e ，十二烷基硫酸钠 T V B M V ：T o b a c c ov e i nb a n d i n gm o s a i cv i r u s ，烟草脉带花叶病毒 U T R ：u n t r a n s l a t e dr e g i o n ，非翻译区 V I G S ：v i r u s i n d u c e dg e n es i l e n c i n g ，病毒诱导的基因沉默 V P g ：v i r a lp r o t e i ng e n o m e l i n k e d ，病毒基因组连接蛋白 目录 中文摘要1 英文摘要3 1
9、前言5 1 1 植物病毒侵染性克隆5 1 。1 1 植物病毒侵染性克隆的类型6 1 1 2 侵染性克隆接种方法1 0 1 1 3 影响植物病毒c D N A 克隆侵染性的因素o 1 1 1 2 利用侵染性克隆研究病毒致病机理1 2 1 3 植物病毒侵染性c D N A 克隆的应用1 3 1 3 1 交叉保护及其作用机制1 3 1 3 2 交叉保护存在的问题1 4 1 3 3 植物病毒表达载体1 4 1 3 4 植物病毒V I G S 载体1 7 1 4 烟草脉带花叶病毒的研究现状1 9 1 5 本研究的目的及意义2 0 2 材料与方法2l 2 1 实验材料。2l 2 1 1 毒原、抗血清和菌株
10、2 l 2 1 2 所用载体及试剂2I 2 1 3 主要实验仪器2 l 2 2 实验方法2l 2 2 15 R A C E 扩增病毒5 - U T R 2 1 2 2 2T V M B V 全长c D N A 克隆的构建2 8 2 2 3T V B M VH C P r o 关键位点的突变3 9 2 2 4 利用T V B M V 弱毒突变体进行交叉保护4 7 2 2 5T V B M V 超表达载体及V I G S 载体的研制。4 7 3 结果与分析5l 3 1T V B M V5 U T R 的扩增5l 3 2T V B M V 侵染性克隆的构建5 1 + 一 3 2 1 融合P C R
11、扩增T V B M Vc D N A 第一段( p 3 5 S H C 2 1 1 0 ) 5 1 3 2 2 扩增包含3 个内含子的第二段( p H C 2 1 1 1 - 6 K 2 6 0 7 5 ) 。5 l 3 2 3T V B M V 基因组第三段( p 6 K 2 6 0 7 6 S m aI ) 的扩增5 3 3 2 4 基于p U C l 9 载体和p C a m b i a 0 3 9 0 载体的酶切鉴定5 3 3 2 5T V B M V 侵染性克隆在三种寄主植物上的症状及病毒积累量5 4 3 2 6 利用p T V B M V - G F P 观察病毒在本氏烟上的移动5
12、 5 3 3H C P r o 对病毒致病力、R N A 沉默抑制活性和协生作用的影响5 6 3 3 1H C P r o 对病毒致病力的影响5 6 3 3 2 不同氨基酸位点的突变对H C P r oR N A 沉默抑制活性的影响6 0 3 3 3 氨基酸突变对H C P r o 与P V X 协生作用的影响6 2 3 4T V B M V 弱毒突变体的交叉保护作用6 4 3 4 1 多位点弱毒突变体的获得6 4 3 4 2 弱毒突变体的交叉保护效果6 6 3 5T V B M V 超表达及V I G S 载体的构建6 9 3 5 1 超表达载体的构建及应用6 9 3 5 2V I G S 载体的构建及应用6 9 4 讨论。7 l 4 15 - U T R 对侵染性c D N A 克隆侵染性的影响7 l 4 2 内含子在侵染性克隆构建中有重要作用7 l 4 3H C P r o 不同位点的突变影响病毒致病力和协生作用的机制7 3 4 4 多位点弱毒突变体的交叉保护作用
