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1、邱昌伟，林德贵 ( 中国农业大学动物医学院，北京海淀l 0 0 0 9 4 ) 横要：为了准确地分析血管内皮生长因子( V a s c u l a re n d o t h e li a lg r o w t hf a c t o r 。V E G F ) 在犬乳腺 肿瘤形成过程中的作用，建立了乳腺肿瘤V E G F 基因实时荧光定量聚合酶链反应检测方法本试验设计了针 对p , f l E G F 两特异性引物，提取乳腺肿瘤b g 织R N A 并扩增出目的片度，将P C R 产物克隆至) J p G E M - TE a s y 载体，经 质粒P C R 扩增、酶切和测序鉴定证实重组质粒构建
2、成功利用实时荧光定量R T - P c R 技术对基I 因m R N A 的表 迭水平进行研究非常可靠，研究结果具有可比性和重复性为下一步对不同犬乳腺肿瘤组织中V E G F 基因表 达的定量打下了基础 关冀词：V E G F ；乳腺肿瘤；实时荧光定量P C R ；犬 乳腺是犬猫肿瘤常发的部位，乳腺肿瘤的发病率仅次子皮肤瘤。据研究报道，犬猫乳腺肿瘤的发病 率是人类乳腺肿瘤发病率的三倍，且该病的发生都与环境因素和遗传因素有关。因此用患原发性乳腺肿瘤 的犬猫来作为研究人类乳腺肿瘤的模型尤为有意义。恶性肿瘤的转移是影响患者预后的主要因素，肿瘤细 胞的血行或淋巴转移包含了一系列复杂的过程，其中肿瘤组织
3、的血管生成及淋巴管生成是必不可少的环 节。大量实验证明，血管内皮生长因子( V E G F ) 在恶性肿瘤的血管生成及转移扩散中起着重要作用，且V E G F 参与了胚胎发育过程中淋巴管网的的形成。有研究表明，V E G F 在结肠癌中表达增高，并与淋巴转移呈正相 关。为此，我们探讨了V E G F 在乳腺癌发生发展中的作用，以便为乳腺癌的综合治疗提供实验数据。 目前，实时荧光定量P C R ( r e a l - t i m eq u a n t i t a t i v eP C R ) 技术已经广泛用于检测基因的表达水平，实时荧光 定量P C R 技术可以非常可靠、高灵敏度的对r m R
4、N A 的表达进行绝对定量，用质粒D N A 构建标准曲线，以标准 曲线对样品m R N A 的表达进行可靠性很高的检测。 在以往的研究中，大多数都是用免疫组织化学的方法或原位杂交对不同的乳腺组织中V E G F 进行检测， 这种方法不能对m R N A 进行绝对定量，只是一种半定量方法。本研究构建了实时荧光定量P C R 检测不同犬 乳腺肿瘤组织中V E G F 基因表达标准品质粒和标准曲线。为进一步阐释血管内皮生长因子( V E G F ) 在肿瘤 发生的分子机理奠定了基础。 1 材料与方法 I , I 材料 新鲜乳腺组织标本取自中国农业大学动物医院2 0 0 5 8 - - 一2 0 0
5、 6 5 手术的患病母犬，平均年龄1 0 岁。包括 正常乳腺组织2 例，乳腺良性肿瘤2 2 例及恶性肿瘤1 8 例( 以浸润性导管癌为主) ，恶性肿瘤中伴有淋巴结转移 者3 例( 1 6 7 ) 。所有的病例在手术前均未接受过放疗或化疗。D H 5 。感受态细胞由农业部兽医诊断中心实验 室保存。 1 2 主要试剂和仪器 R N A g e n t s RT o t a lR N AI s o l a t i o nS y s t e m 提取试剂盒( P r o m e g a 公 ) 、P C R 所用试剂p r o m e g a 公司) 、 D E P C ( P r o m e g a
6、 公司) 、S Y B R * G r e e nq P C RK i t ( F I N NZ Y M E S 公司) 、肿删R e v e r s eT r a n s c r i p t a s e ( P r o m e g a 公司) 、E c o R I ( T a K a R a 公司) 、质粒快速提取试剂盒( 博大泰克公司) 、p G E M - TE a s y V e c t o rS y s t e m s ( P r o m e g a 公司) 、E Z N AG e lE x t r a c t i o nK i t ( P r o m e g a 公司) 、T G
7、R A N D I E N TP C R 仪呷A D 公司) 、实时荧光定量 P C R 仪( O P T I C O N2 型，M JR e s e a r c h 公司) 。 1 5 I 豢 燃恭惹 嚣建 型啪垒乳篇 羞 武汉华中农业大学 2 0 0 6 1 0 1 3 方法 1 3 I 组织R N A 提取将在液氮中冻存的新鲜乳腺组织取出，组织匀浆后，按照K N A g e n t s RT o t a lR N A I s o l a t i o nS y s t e m 试剂盒操作说明提取组织的R N A ，并根据A 2 酏值计算R N A 的浓度，以A 2 A 2 的比值判断其 纯
8、度。提取的R N A 用D E P C 处理的灭菌三蒸水融解，8 0 保存备用。 1 3 2 组织总R N A 的R T - P C R 1 3 2 1 引物设计：按照已经发表的犬V E G F 基因m R N A 序列( G e r d 3 a n k 登录号为X M 5 4 0 0 4 7 ) 分析并设计一 对特异性引物。上游引物为5 - C A GG C GT A TG C A 舭AG A - 3 ，下游引物为5 - G A GG T GG c TT G T G c rG G TG T - 3 ，扩增目的片断长度为3 9 9 b p ( 1 4 5 5 4 3 b p ) 。 1 3 2
9、 2 反转录( 1 合成c D N A ：R T 的反应体积为2 0 # L ，逆转录反应体积如下：样品R N A 2 此、 2 5 m m o l L d N T P 2 # L 、o l i g o ( d T ) 1 8 ( 1 6 p m o l L ) 2 t t L ，5 x 逆转录缓冲液4 皿、A M V 反转录酶I # L ( 5 u ) 、 R N a s m l f L ( 4 0 u ) * b 充D E P C 处理过的水至体积2 0 f t L 。上述成分混匀后至于P C R 仪器中，4 2 4 5 m i n , 9 9 C 5 m i n 灭活A M V 酶。 1
10、 3 2 3P C R 扩增：P C R 扩增体系为反转录产物2 # L 、1 0 x P C R 反应缓冲液舢L 、2 5 m m 0 1 L d N T P 2 # L 、 O 5 u 肛L T a q D N A 酶2 # L 、1 0 p m o l # L 上下游引物各I # L 、1 5 m m o l L M g C l 2 2 弘L ，补充D E P C 处理过的水至体积2 0 # L 。反应条件为：9 4 预变性5 r a i n ：9 4 ( 2 变性3 0 s 、5 5 退火4 5 s 、 7 2 延伸4 0 s ，共3 6 个循环；7 2 延伸7 m i n 。 1 3
11、 3 重组标准品质粒制备 1 3 3 1P C R 产：物纯化：P C R 产物经1 5 琼脂糖电泳，胶回收按照E Z N A o G e lE x t r a c t i o n 磁t 的操作说明对P C R 扩增片段进行纯化、回收。 1 3 3 2P C R 产物与载体连接、转化：按照p G E M 。- TE a s yV e c t o rS y s t e m s 试剂盒的说明书将纯化产物与 p G E M T 载体在T 4 D N A 连接酶作用下进行连接反应，构建扩增产物的重组质粒。连 接体系为5 皿，其反应体系为：p G E M c D - TE a s yV e c t o
12、r ( 5 0 n g ) 1 此、P C 贼化产物1 此、T 4 D N 硝毫接酶0 5 此、2 连接酶b u f f e r 2 5 皿。将连接体系置于4 C 水浴中过夜。取待连接产物5 皿加入试剂A 2 0 “L 与7 5 此无菌水，稀 释成t 0 0 肛L ，冰上备用。将混合液加A 8 0 1 0 0 p L 感受态细胞并混匀，冰浴2 0 m i n ，室温放置1 0 m i n 。加入 4 0 0 9 L L B 培养基，3 7 C 2 0 0 r p m 摇l O - 4 0 m i n 。涂于A m p 、X G a L 和I P T G 处理的L B 琼脂平板上，3 7 。C
13、过夜培养， 挑取单个白色菌落，在A m p + L B 液体培养基 3 7 C 摇9 1 6 h 。 1 3 3 3 重组质粒的提取和鉴定：按照质粒快速提取试剂盒的操作要求对经A m p + L B 液体培养基3 7 C 、 2 0 0 r r a i n 摇振培养的大肠杆菌进行重组质粒D N A 提取，对提取的质粒聊蛆进行重组质粒P C R 、酶切和测序 鉴定。 1 3 3 4 重组质粒定量标准曲线的建立：测定阳性重组质粒的O D 值，计算出拷贝数。将标准品重组质粒进行 1 0 倍系列稀释，以系列稀释的质粒为模板在实时荧光定量P C R 仪上扩增。反应为2 0 皿体系，反应组分为： M i
14、x l o b t L 、上游和下游引物( 1 0 p m o l L ) l 此、重组质粒D N A 2 u L 、灭菌三蒸水7 止。反应条件与常规P C R 条 件相同，在每个循环内加入读板步骤，总延伸结束后，加入溶解曲线的制备( 6 5 9 5 。C 范围内，每0 2 读板一 次) 步骤。反应结束后，计算机自动得到标准曲线。 2 结果 2 1 组织R N A 提取和目的基因片段的扩增 组织提取的总R N A 紫外分光A 2 A 2 8 0 为1 8 2 0 之间，电泳结果表明R N A 分子保持完整。经R T - P C R 扩增， 产物用1 5 琼脂糖凝胶电泳，获得大约4 0 0 b
15、p 左右的目的条带。序列测定表明，获得的目的条带同原始序列 的同源性为1 0 0 。 2 2 标准模板的鉴定 对重组质粒D N A 进行P C R 扩增。产物用1 5 琼脂糖凝胶电泳，获得4 0 0 b p 左右片段( 图1 ) ，和组织m R N A 经R T - P C R 扩增片段大小一致。对提取的重组质粒D I N A 进行E a o R I 酶切，酶切鉴定的结果如图2 所示。对重组 1 5 2 全国兽医外科学第1 3 次学术研讨会小动物医学第1 次学术研讨会暨奶牛疾病第3 次学术讨论会论文集 ：_ _ _ _ 。 质粒D N A 的测序结果经P u b m e db l a s t 分析，插入D N A 片段的序列与原始序列片段的同源性达到1 0 0 ，说明 所插入的外源基因为目的基因片段，即质粒连接、转化成功，标准质粒构建成功。 M M a r k e rD L 2 0 0 0 ；1 - 4 重组质粒的P C R 扩增片段 M M a r k e rD L 2 0 0 0 ；1 - - 4P C Rp r o d u c t s 图l 重组质粒的P C R 扩增 F i g 1P C Rd e t e c t i o no f p l a s m i d M 。M a r k e r D L 2 0 0 0 ；1 - 3 重组质粒的点幻R I 酶切
