《新型b细胞亚群的发现及其免疫调控功能与机制的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《新型b细胞亚群的发现及其免疫调控功能与机制的研究（114页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第二军医大学 博士学位论文 新型B细胞亚群的发现及其免疫调控功能与机制的研究 姓名：鲍嫣 申请学位级别：博士 专业：基础医学 免疫学 指导教师：曹雪涛 20100601 新型B 细胞亚群的发现及其免疫调控功能与 机制的研究 摘要 近年来，人们对于免疫细胞亚群及其功能的认识大为拓展，特别是对于T 细胞 亚群的研究有了许多新的进展，除了以往广泛公认的T h l 、T h 2 之外，近年来对于 调节性T 细胞( T r e g ) 、T h l 7 、T h 9 ，T f h 等T 细胞亚群的进一步区分与功能特征的研 究以及与临床疾病的联系，使得人们对于免疫应答与免疫调控的细胞与分子机制研 究有了更
2、深入的认识。此外，对于巨噬细胞和树突状细胞( D C ) 的亚群、特别是 M 2 和调节性D C 亚群的研究也有了新的进展。但是，目前对于机体体液免疫中最关 键的免疫细胞B 细胞( Bl y m p h o c y t e s ) 的亚群及其相应的功能特征的研究相比而言 比较少。过去认为B 细胞通过分泌抗体，在体液免疫系统中发挥“指挥家”的作用；B 细胞还是一类重要的抗原提呈细胞，参与对抗原的摄取、加工、提呈，在启动获得性 免疫应答中起重要作用；此外，B 细胞还可以通过分泌多种细胞因子和某些趋化因子 以及表达某些重要膜分子，参与免疫应答的调控。可见，B 细胞具有功能多样性，通 过进一步研究B
3、细胞的亚群组成及其功能特征，将有助于全面认识B 细胞的功能和 作用，从而对免疫应答与调控的方式与机制增添新的学术观点。 根据表面分子、定位和功能特点的不同，B 细胞被分为B 1 细胞和B 2 细胞。 B 2 细胞即为传统意义的B 细胞。而B 1 细胞主要在胚胎的胎肝、网膜中发育，分布 于腹腔、胸腔和肠壁固有层中，又分为B 一1 a 细胞( C D ll b + C D 5 + ) 和B 1 b 细胞( C D ll b + C D 5 。) 。B 1 细胞在I L 1 0 帮助下保持自我更新能力，通过识别某些细菌表面共有的 多糖抗原和一些变形的自身抗原，B 一1 a 细胞及其分泌的自身抗体在幼
4、儿的抗感染免 疫中提供有效保护，而B 1 b 细胞在感染时则能对多糖和其他非T 细胞依赖性的抗原 产生长效的抗体应答。近年来，人们发现了一类可以分泌I L 1 0 的B 细胞，根据其功 能而将之称为调节性B 细胞( r e g u l a t o r yBc e l l ) ，作为一类新的B 细胞亚群，其能够 调节机体免疫应答，大量的基础研究和临床证据表明，B 细胞的功能具有明显的异质 性，提示B 细胞在免疫应答被激活后可能分化为多个不同的功能亚群参与并调控免 疫应答，参与肿瘤、自身免疫性疾病等疾病的发生发展过程，因此，有关新的B 细 胞亚群的发现与功能分析成为近年来免疫学研究的热点之一。 由
5、于天然免疫系统是机体抵御病原体入侵的第一道屏障，近年来已成为免疫学研 究的重要领域，天然免疫应答由N K 细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和 肥大细胞等天然免疫细胞介导，通过模式识别受体识别细菌、真菌及病毒成分并活化， 引发下游的多种免疫效应，但B 细胞在其中的作用如何尚不明确。但一方面，B 细胞 能够不依赖B C R 信号介导而被活化；另一方面，由于B 细胞能表达多种T o l l 样受体 ( 如T L R 2 、T L R 3 、T L R 4 、T L R 5 、T L R 7 、T L R 9 ) 和其他的模式识别受体识别，那 么病原体感染后微环境中存在的多种T L R 配体及
6、模式识别配体有可能能够通过与B 细胞上的受体交联，激发下游的信号传递，从而为B 细胞参与天然免疫反应以及随 后调控免疫反应奠定了基础。 考虑到B 细胞组成的异质性以及B 细胞参与天然免疫应答和调控获得性免疫应答 的多样性功能特点，我们在本研究中分为三部分，研究了病原体感染或者病原体成分 激活天然免疫反应之后B 细胞的亚群组成，以及我们所发现和鉴定的新型B 细胞亚群 的功能特点与相关作用机制，还对B 细胞发育和功能分化的转录因子调控机制进行了 初步探讨，以期为B 细胞参与免疫应答调控及其作用机制，以及其功能分化的分子机 制增添新的认识。 一、C D l 9 + D X 5 + B 细胞亚群( N
7、 K B ) 的发现及其参与天然免疫、 调控获得性免疫的作用与相关机制 为了探索B 细胞在病原体感染后机体免疫应答中的作用，我们对李斯特菌、大肠 杆菌、水泡性口炎病毒( V e s i c u l a rs t o m a t i t i sv i r u s ，V S V ) 感染的小鼠模型及T L R 配体 L P S 、C p G O D N 、p o l yI ：C 注射的小鼠炎症模型的各脏器B 细胞采用流式细胞仪分析， 发现了一群由病原体感染和T L R 配体诱导增加的并广泛分布于骨髓、脾脏、淋巴结组 织中C D l 9 + D X 5 + 新型细胞亚群。为了进一步探索其特征，我们动
8、态检测了其产生过 程，发现脾脏中C D l 9 + D X 5 + 双阳性细胞在细菌感染后第3 天数量开始显著上升，到第 7 天达到峰值，其后逐渐下降，直至感染后第1 7 2 l 天恢复至初始水平；而在L P S 、 C p G O D N 、p o l y I ：C 体内注射所诱导的小鼠模型中，C D l 9 + D X 5 + 细胞数量于刺激后第 5 天达高峰，随后下降；结果表明，该细胞亚群可被病原体感染或者病原体组分刺激 所诱导产生，提示其可能会参与或者调控机体抗感染的天然免疫及获得性免疫应答。 流式分析发现C D l 9 + D X 5 + 双阳性细胞表面表达N K 及B 细胞的相关表
9、面标志， 包括m l g D 、m l g M 、B 2 2 0 、I A e 、C D 4 0 、C D l5 4 、C D 8 6 、L y 4 9 A 、L y 4 9 C I 、L y 4 9 D 、 N K G 2 D 、N K G 2 A C E 、C D 4 3 、C D 2 5 、C D l 2 2 、C D l l b 等。电镜下C D l 9 + D X 5 + 双 阳性细胞染色质疏松，胞浆富含线粒体和高尔基体。胞内染色及E L I S A 结果显示其 一2 分泌I F N 小I L 10 【、I L 1B 、I L 6 、G r a n z y m e B ，而不分泌T
10、h 2 型细胞因子I L 4 和I L 1 0 。 此外，由于该细胞具有B 细胞的表面标志，我们检测其免疫球蛋白分泌，发现该细 胞在L P S 刺激后可以分泌I g G 2 a 、I g G 2 b 、I g G 3 、I g M ，采用李斯特菌感染B 细胞缺 陷B t k - ，。小鼠及N K 细胞剔除小鼠证明体内诱导产生的该细胞亚群来源于B 细胞而非 N K 细胞，由此推测C D l 9 + D X 5 + 细胞是一个具有N K 样表型和分泌细胞因子特征的 B 淋巴细胞亚群( 我们简称N K B ) 。 我们在体外将D X 5 C D l 9 + B 细胞分别与纯化的C D 4 + 或C
11、D 8 + T 细胞、N K 细胞、 树突状细胞、巨噬细胞进行共培养，并加入L P S 刺激，发现树突状细胞可以诱导 D X 5 + C D l 9 + N K B 细胞的产生。为进一步明确其产生机制，我们在共培养体系中分别 采用0 4 9 Mt r a n s w e l l 或者加入抗I L 6 、I L 1 1 3 、I L 1 2 、C D 4 0 、C D 4 0 L 的单克隆抗体， 发现树突状细胞可以通过C D 4 0 C D 4 0 L 途径诱导N K B 细胞产生，且其分泌的I L 6 和I L 1B 对这一过程有促进作用，李斯特菌感染的C D Il c D T R 、C d
12、4 0 小、C d 4 0 1 斗小鼠 体内实验结果进一步证实了一旦缺失了树突状细胞、C D 4 0 一C D 4 0 L 相互作用，N K B 细胞将不能被诱导产生；而在李斯特菌感染仅能在I n f ，及1 1 6 壬小鼠体内诱导产生少 量N K B 细胞。证明了N K B 的产生需要树突状细胞通过C D 4 0 C D 4 0 L 与B 细胞前体 相互作用，I L 6 和I L 1p 对这一诱导过程有促进作用。 接下来我们研究了N K B 细胞在细菌感染天然免疫应答的作用，发现N K B 细胞 通过分泌的I F N 吖活化巨噬细胞，可以增强其对胞内菌的杀伤，抑制李斯特菌在胞内 的数量增长；
13、体内回输N K B 细胞也显著降低李斯特菌感染早期的肝脾细菌负荷并上 调血清I F N 吖水平，但回输I f n r 小N K B 细胞则无类似效应。说明N K B 细胞能通过其 分泌的I F N - 7 激活巨噬细胞，参与细菌感染早期的天然免疫应答反应。 由于N K B 细胞数量高峰出现于感染第7 天，因此我们对C 5 7 B L 6 小鼠回输 C D 4 5 1 + O T IC D 8 + T 细胞，然后感染能分泌O V A 的李斯特菌株( L M o V A ) ，旨在 研究N K B 细胞在获得性免疫应答的作用。结果发现，与感染后第7 天的N K B 细胞 共培养可以促进李斯特菌感染
14、小鼠抗原特异性C D 8 + T 细胞的凋亡。进一步研究发现 N K B 细胞来源的I F N - 3 , 能上调其本身表达F a s L 及O T IC D 8 + T 细胞F a s 的表达，一 旦阻断I F N - , 或F a s F a s L 信号，则N K B 细胞诱导C D 8 + T 细胞的凋亡比例降低。我 们在L M O V A 感染B t k 乒小鼠前后分别回输C D 4 5 1 + O T 1C D 8 + T 细胞与N K B 细胞、 N K 细胞或B 细胞，发现细菌感染7 天后N K B 细胞回输组C D 8 + T 细胞数量较与N K 细胞或B 细胞回输组显著下降
15、，但C D 8 + T 细胞表面活化标志C D 4 4 、C D 6 2 L 、C D 6 9 较对照组表达无显著变化。采用C F S E 标记的O T IC D 8 + T 细胞与N K B 细胞共同回 输并检测李斯特菌感染3 天后T 细胞增殖，结果表明O T IC D 8 + T 细胞增殖并无差异， 3 结果表明，N K B 细胞在体内不显著影响抗原特异性C D 8 + T 细胞产生。若采用I f n r 手 或F a s l 士小鼠N K B 细胞与O T - IC D 8 + T 细胞共同回输，对O T - IT 细胞的数量及活化 并无影响。因此，于感染第7 天大量诱导产生的N K B
16、 细胞通过I F N 吖和F a s F a s L 通 路可以促进抗原特异性C D 8 + T 细胞凋亡，使得抗原特异性获得性免疫应答反应受到 适度的负相调控，从而利于维持免疫应答的稳定性。可见，我们发现的这群由病原体 感染诱导产生的C D l 9 + D X 5 + N K B 细胞在天然免疫应答的早期通过I F N - r 激活巨噬细 胞而起促进作用，发挥了N K 细胞样的天然免疫效应细胞的作用；但在获得性免疫应 答的晚期大量产生之后， 其通过I F N - Y 和F a s F a s L 通路诱导抗原特异性C D 8 + T 细 胞凋亡而对免疫应答反应起负相调控作用，发挥了调节性B 细胞样的作用，表明该 新型B 细胞亚群具有独特的双重免疫功能，即被病原体感染诱导产生之后反馈促进 天然免疫诱导以利于机体清除病原体，但另外一方面，通过负相调控抗原特异性C D 8 + T 细胞应答反应以利于免疫应答处于平衡状态，从而避免免疫应答过度活化之后造成 机体病
