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1、华中科技大学 硕士学位论文 小麦叶绿体表达载体构建和遗传转化 姓名：任科云 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：何光源;刘勇 20090520 I 摘摘 要要 1962 年Ris和Plaut首次证明了叶绿体中存在DNA以来烟草水稻玉米菠 菜苜蓿衣藻等多种高等植物和藻类的叶绿体基因组的测序工作已经完成多年 以来进行的核基因工程因花粉漂移现象造成对生物的安全问题而引起争议而叶 绿体具有母性遗传定点整合高效表达安全性和稳定性好等优点受到更多研 究者的关注目前叶绿体的遗传转化体系已经在烟草马铃薯 番茄 油菜 水稻等几种植物中获得成功而在主要的粮食作物小麦中此方面的研究还比较少 本
2、课题参考其他作物的转化体系的方法来建立小麦叶绿体转化体系 此体系对小 麦的分子育种有着重大的影响得到如下结果 1从 Genbank 数据库中查到小麦叶绿体基因组基因rbc L 和trn M trn V 基因 设计 2 对特异引物,从小麦叶绿体基因组中克隆到 2 个片段作为小麦叶绿体遗 传转化的 2 个同源重组片段 2在上述得到 2 个同源重组片段的基础上首先利用生物信息学的手段预测小麦叶 绿体基因 16 S rRNA 特异启动子区域,然后通过 PCR 方法从小麦叶绿体基因组中 分离到 16 S rRNA 的启动子 3用分离到的启动子序列分别连接筛选基因npt II 和报告基因gfp,并与烟草的
3、 PsbA 3终止子组成表达框,构建小麦叶绿体基因组定点整合表达载体 pRNGY我 们期望通过基因枪方法轰击小麦幼胚经卡拉霉素筛选获得分化愈伤组织和抗性 植株 我们成功的构建了小麦叶绿体表达载体但是在进行遗传转化时我们没有取得成 功 关键词关键词小麦叶绿体基因组表达载体同源重组基因克隆外源基因 遗传转化 II Abstract Since the chloroplast DNA was proved by Ris and Plaut in 1962, genome sequence diagrams of higher plants,such as tobacco, rice, corn, s
4、pinach, alfalfa, and other Chlamydomonas chloroplastand algae had been completed.Recently,the phenomenon of pollen drift caused considerable dispute in nuclear genetic engineering.Because chloroplast had many advantages,such as maternal genetic, site- specific integration, high- level expression,saf
5、ey and stability, researchers pay more attention to chloroplast genetic engineering. At present, tobacco, potato, tomato, rapeseed and rice have been transformed successfully.But related research does not appear in wheat. This experiment was to establish wheat chloroplast transformation system by re
6、lated transformation systems.It had significant effect on GM varieties of wheat and resistance breeding.The results are as follows: 1) We got the sequence of rbcL gene and trnM, trnV gene from Genbank database and designed two pairs of specific primers, and then cloned them from Wheat chloroplast ge
7、nome. 2) we predicted 16 S rRNA specific promoter region of Wheat chloroplast genome by bioinformatics,and then cloned it from Wheat chloroplast genome by PCR. 3) A site- specific integration and expression vector for wheat chloroplast genetic transformation, pRNGY, was constructed. It contained the
8、 homologous recombinant fragment 1- the rbc L, the homologous recombinant fragment 2- integral DNA fragment of trnM and trnV, the selectable marker npt II gene and the reporter gene gfp were regulated by the promoter Prrn and the terminator PsbA 3 from wheat chloroplast genome.We expected that we bo
9、mbarded wheat immature embryos by gene gun, and then we could get spectinomycin- resistant callus by antibiotics of Kanamycin. III We have successfully constructed the expression vector of wheat chloroplasts, but genetic transformation in the time we did not succeed in tansforming it into wheat chlo
10、roplast genome. Keywords: wheat chloroplast genome express vectorhomologous recombinant gene cloning foreign gene transformation 独创性声明 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果尽我所知除文中已经标明引用的内容外本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出贡献的个人和集体均已在 文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名 日期 年 月 日 学位论文版权使
11、用授权书 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留使用学位论文的规定即学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版允许论文被查阅和借阅 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 保密 在_年解密后适用本授权书 不保密 请在以上方框内打 学位论文作者签名 指导教师签名 日期 年 月 日 日期 年 月 本论文属于 1 1 绪绪 论论 1.1 课题背景 1.1 课题背景 近 20 年来植物基因工程方法已经成功的应用到农业生产中并且已经培育 出高抗高产和优质的转基因作物新品种199
12、9 年美国种植半数以上的玉米棉花 和大豆都是转基因产品随着科技的发展以及世界对转基因工程的重视基因工程 的研究不断深入在此过程中人们认识到细胞核基因组遗传转化工作非常困难 其原因为基因组过大结构复杂外源基因难以整合拷贝不可控背景复杂 后代表达不稳定易导致基因失活基因沉默及位置效应等一系列问题而且转 基因植物在田间释放后花粉会转移到环境中这样会造成基因污染进而打 破原来的生态种群平衡国外许多学者对花粉漂移问题进行过专门的研究结果发 现在靠近转基因作物甚至是相距很远的作物种植地带无论是野生近缘种还是现代 非转基因栽培种在植株体内都能检查到转基因的扩散1- 4最近Losey 等人的实 验表明抗虫转基
13、因玉米的花粉能够对非翅目的昆虫蝴蝶产生毒害效应5这更加重 了人们(尤其是西欧国家)对转基因植物的担忧为了解决细胞核遗传转化这一严重 的弊端自 1998 年起 人们就开始了叶绿体遗传转化研究这种研究已经成功的 应用到烟草水稻拟南芥马铃薯和油菜 5 种植物这一转化系统成为植物基因 工程中新的生长点6 1.2 叶绿体 1.2 叶绿体 叶绿体是绿色植物进行光合作用的必要器官它是一种质体有圆形 卵圆形或盘形 3 种形态叶绿体因为含有叶绿素 ab 而呈绿色叶绿素 a b 能够吸收光能并通过光合作用将光能转变成化学能叶绿体为扁球状 厚约 2.5 m直径约 5 m具有双层膜叶绿体内部含有间质间质中为 呈溶解状
14、态的酶和片层叶绿体片层由闭合的中空盘状的类囊体垛堆而成 高能化合物三磷酸腺苷(ATP)就是在这里形成 可以说大部分生命活动所需的能量都来源于太阳能光能绿色植物是 主要的能量转换者因为它们均含有叶绿体这一完成能量转换的细胞器并 且能够利用光能同化二氧化碳和水合成贮藏能量的有机物同时产生氧 2 所以绿色植物的光合作用是地球上有机体生存繁殖和发展的根本源泉 叶绿体是半自主性细胞器因为它具有自身的 DNA 和蛋白质合成体系叶 绿体具有与原核细胞相似的组成与结构能够独立进行转录和翻译和线粒体一 样叶绿体只能合成自身需要的部分蛋白质其余部分在细胞质游离的核糖 体上合成通过载体运送到叶绿体后发挥其相应的功能
15、叶绿体 DNA 都可 以进行自我复制(半保留复制) 但它们的复制要受细胞核的调控,复制所需的 DNA 聚合酶都由核基因编码,在细胞质核糖体上合成7植物体内由 ctDNA编码的 RNA 和多肽有 4 种 rRNA20S16S4.5S 及 5S20 种烟草或 31 种地 钱tRNA 及 90 多种多肽 1.3 叶绿体基因组 1.3 叶绿体基因组 在分子生物学不断发展下尤其是大规模测序技术的快速发展叶绿体基因组 的研究也越来越深入1986 年首次获得烟草(Nicotiana tabacum)8图 1.1和地钱 (Marchantia polymorpha)9叶绿体基因组的完整序列以来叶绿体基因组数据
16、库日益 充实目前包括生物界不同物种叶绿体基因组数据例如小麦图 1.2和水稻等 这些数据为叶绿体的遗传转化提供了相当的帮助从而使叶绿体遗传转化成为继核 转化的的另一个热点 叶绿体基因组 DNAChloroplast DNA, cpDNA一般为双链环状分子缺乏组 蛋白和超螺旋一般周长约 40- 45 m分子量约 90 MD叶绿体基因组的大小差别 也比较大 如某种寄生性的绿藻 (Helicosporidium sp.ex Simulium jonesii)只有 85 kD 最大的伞藻Acetabularia达 2000 kD 10 不同物种叶绿体 DNA 的含量也不同 叶绿体 cpDNA 为多拷贝同样不同物种拷贝数差异也比较大例如甜菜叶细胞中
