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1、大肠埃希菌的检测 检测意义 大肠埃希菌是肠道中存在的正常菌群 ，故常来源于人和动物的粪便，所以 常作为粪便污染的指标。一旦被检药 物中查出大肠埃希菌，表明该药品已 被粪便污染，可能存在肠道致病菌和 寄生虫卵，患者服用该药物后有引起 感染的危险。因此，大肠埃希菌被列 为重要的卫生指标菌。国家药品卫生 标准规定口服药品不得检出大肠埃希 菌。 检测原理： 中国药典采用了MUGIndole快速测定药品 中大肠埃希菌。 在MUG试验中，将MUG（4-甲基伞形酮葡 糖苷酸）作为目标菌的基本营养物加入培养 基中，被大肠埃希菌的-葡萄糖醛酸酶直接 分解产物又作为一种指示系统，在366 nm紫 外光下呈现兰白色
2、荧光，即MUG阳性；若无 荧光，即MUG阴性。 靛基质（Indole）试验中，大肠埃希菌能分 解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存 在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基 氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合 物。 因此根据大肠埃希菌的这一性质， 对MUG呈阳性者，再加对-甲氨基苯 甲醛试剂数滴，轻摇试管，培养液 上层呈现玫瑰红色者(阳性)，报告检 出大肠埃希菌。如果两者都为阴性 ，报告未检出大肠埃希菌。如果一 阴一阳，需要进一步的培养和生化 试验检查。 本方法对大肠埃希菌的检出率达98 。 培养温度：控制菌培养温度为30 35。 实训器材： 蒸汽灭菌物品： 1.乳糖胆盐发酵培养基试管10
3、支 干热灭菌物体： 5mL移液管1支 1mL移液管5支 流程图： 甲基伞形酮葡糖苷酸(MUG)培养基 胨10.0g 硫酸锰0.5mg 硫酸锌0.5mg 硫酸镁0.1g 氯化钠5.0g 氯化钙50.0mg 磷酸二氢钾0.9g 磷酸氢二钠6.2g 亚硫酸钠40.0mg 去氧胆酸钠1.0g MUG 75mg 水1000mL 除MUG外，取上述成分，混合。微温溶 解，调节PH7.2-7.4，加入MUG，溶解， 每管分装5mL，灭菌。 实验步骤： 取供试供试液1mL，直接或处理后接种 在制好的100mL胆盐乳糖培养基中,在 37恒温箱中培养1824 h，进行增 菌培养。 取上述培养物0.2mL,接种至含
4、5mL MUG培养基的试管内培养，于5小时， 24小时在366nm紫外灯光下观察，同 时用未接种的MUG培养基做本底对 照。 若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性 ，不呈现荧光，则为MUG阴性。 观察后，沿着培养管的管壁加入数滴 靛基质试液，叶面呈玫瑰红色，为靛 基质阳性，呈试剂本色，为靛基质阴 性。 本底对照应为MUG阴性和靛基质阴 性。 靛基质实验原理 某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸， 生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应 表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛 结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合 物。 伊红美蓝培养基（EMB培养基 ） 蛋白胨水琼脂培养基100ml，20%乳糖 溶液2ml，2%伊红水溶液
5、2ml，0.5%美蓝 水溶液1ml，将已灭菌的蛋白胨水琼脂培 养基（pH7.6）加热溶化，冷却至60左 右时，再把已灭菌的乳糖溶液，伊红水溶 液及美蓝溶液按上述量以无菌操作加入。 摇匀后，立即倒平板。乳糖在高温灭菌易 被破坏必须严格控制灭菌温度，115灭 菌20min。 结果分析： 1.MUG、靛基质结果判断 MUG培养结果：在366nm紫外线下观察 靛基质结果：液面呈玫瑰红色，为靛基质 阳性；呈试液本色，为靛基质阴性 MUG阳性、靛基质阳性，判检出大肠杆菌 ； MUG阴性、靛基质阴性，判未检出大肠杆 菌； MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基 质阳性，需进一步做以下检查 2。EMB培养结
6、果判断 EMB培养18-24h后，检查有无疑似大肠 埃希菌菌落（大肠埃希菌落形态特征见表 ），若无，判供试品未检出大肠埃希菌； 若有，进一步做以下试验大肠埃希菌落形 态特征 培养基菌落形态 EMB 呈紫黑色、浅紫色、篮紫色或粉红 色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色 中心，圆形，微突起，边缘整齐， 表面光滑，湿润，常有金属光泽。 检验依据： 2010年版中国药典二部 附录J 微生物限度检查法检验标准规 定：口服制剂细菌数1g不得超过1000 个；1ml不得超过100个。霉菌及酵母 菌数1g不得超过100个。控制菌1g（ 1ml）不得检出大肠埃希菌。 注意事项 1实训过程要严格无菌操作。 2供试液稀释及注入培养皿时应摇匀 再取，供试液从制备至加入培养基不得 超过1h. 3配制MUG培养基时，务必调pH，否 则pH偏高，MUG分解，本身则显荧 光。 4.培养时间：供试品培养液接种于MUG培 养基中的培养时间，一般在4h、24h 观察 是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确 判断时，该延长培养至48h再观察结果。 谢谢观看！ ！
