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1、中山大学 博士学位论文 大豆异黄酮人体代谢的差异及不同成分雌激素活性的研究 姓名：郭开平 申请学位级别：博士 专业：营养与食品卫生学 指导教师：苏宜香 20090602 中山大学博士学位论文大豆异黄酮人体代谢的羞异及不同成分雌激素活性的研究 大豆异黄酮人体代谢的差异及不同成分 雌激素活性的研究 专业：营养与食品卫生学 博士研究生：郭开平 导师：苏宜香教授 摘要 大豆异黄酮的主要成分是d a i d z e i n 、g e n i s t e i n 和g l y c i t e i n - - - 种游离型及其9 种相 应糖甙，由于3 种游离型与1 7 p 雌二醇的化学结构部分相似，学者们推
2、测，二者 的苯环都可以与雌激素受体结合，从而具有类雌激素和抗雌激素双重作用，这种 推测得到了不少研究的证实。其中，有流行病学调查和人体研究显示大豆的摄入 可以降低乳腺癌、围决经期骨质疏松和心血管疾病等的发病的危险。但部分研究 也揭示，大豆异黄酮对人体的生物学效应存在较大的差异，研究者给出的解释是， 因为多数大豆异黄酮在肠道需要经过代谢才能吸收，而人体对其代谢可能存在差 异，其中人体产生e q u o l ( e q u 0 1 ) 或O D e s m e t h y l a n g o l e n s i n ( O - D M A ) 的能力受到特 别关注。 E q u o l 和O D
3、M A 是大豆异黄酮D a i d z e i n 经肠道细菌代谢的产物，因为具有 与1 7 p 雌二醇更为相似的化学结构，而被认为能选择性的结合雌激素D 受体而发 挥重要的生物学活性。有研究显示，不同人群从D a i d z e i n 产生e q u o l 或O D M A 的能力存在差异。如西方人群中仅约2 0 3 0 的人可以将D a i d z e i n 代谢为e q u o l ， 而8 0 - 9 0 的人可以将D a i d z e i n 代谢为O D M A 。而日本人将d a i d z e i n 代谢为e q u o l 的人约为5 0 ，推测，相对于西方人，亚洲
4、人群可能有更多的e q u o l 产出者和更 少的0 D M A 产出者。作为具有传统摄入大豆及其制品的我国居民，其D a i d z e i n 代谢成e q u o l 的能力及其与相关疾病的关系，值得研究。 为此，本研究的第一部分将以广州2 0 - - 6 9 岁居民为对象，进行横断面调查， 中山大学博士学位论文 大豆异黄酮人体代谢的差异及不同成分雌激素活性的研究 了解中国成年人在日常的饮食状态下、在负荷一定量大豆异黄酮3 天后其尿e q u o l 和0 D M A 的排出情况，并比较e q u o l 和O D M A 产出者和非产出者人体测量学 指标以及血脂、血糖和血尿酸的差异。
5、 以往的研究显示，大豆异黄酮具有双重生物学活性，它可以发挥类雌激素活 性也可发挥抗雌激素活性。一些机制研究认为，大豆异黄酮主要通过结合雌激素 受体E R a 和E R 3 ，影响接下来的一些基因表达方面转录因子的配位体活化功能， 从而发挥其雌激素作用。但其发挥作用的机制还不十分明了。 作为一类化学物质，大豆异黄酮的生物作用的差异也可能归因子其不同成分 作用的差异。其中，大豆异黄酮各成分及其代谢产物的雌激素活性的差异，以及 大豆异黄酮不同成分与雌激素受体结合能力的差异，可能解释大豆异黄酮的生物 作用的差异的部分机制。 为此，本研究的第二部分将以雌激素依赖的M C F 7 细胞为研究靶点，以1 7
6、 B 雌二醇为对照，在体外研究大豆异黄酮不同成分对雌激素依赖性细胞M C F 7 生 长的影响，拟确定大豆异黄酮不同成分的雌激素活性及其活性的差异。同时，以 雌性去势荷瘤裸鼠为研究对象，以1 7 B 雌二醇为对照，研究大豆异黄酮不同成 分对裸鼠荷瘤的影响，以期从细胞和整体两个层面揭示大豆异黄酮不同成分雌激 素活性及其作用强度的差异。为探讨大豆异黄酮不同成分雌激素活性差异的机 制，本课题还以1 7 6 雌二醇为对照，研究和比较了大豆异黄酮不同的成分及代 谢产物对通过E R a 或者E R p 介导的基因转录活性的影响，以期揭示，大豆异黄 酮不同的成分及代谢产物雌激素活性的作用通路。 研究内容与方
7、法 1 大豆异黄酮人体代谢的差异 研究设计采用横断面研究方法，拟招募2 0 0 名研究对象，年龄范围2 0 一6 9 岁，男女各半。采用食物频数问卷和三日膳食记录调查对象的膳食情况。分析比 较对象进食日常饮食及负荷大豆异黄酮3 天后2 4 小时尿中大豆异黄酮及其代谢 产物排出的差异。测定，对象空腹血脂、血尿酸和血糖的水平，拟分析其与大豆 异黄酮及代谢产物排出之相关关系。 中山大学博士学位论文 大豆异黄酮人体代谢的差异及不同成分雌激素活性的研究 研究对象研究对象纳入标准为，在当地居住5 年以上，年龄2 0 6 9 岁，其 中年龄2 0 2 9 、3 0 - 3 9 、4 0 - 4 9 、5 0
8、 - 5 9 、6 0 - 6 9 岁的男女各2 1 人，总共2 1 0 名。排 除有消化系统疾病者、一个月内曾使用激素或者抗生素者及怀孕者。 膳食调查及评价使用量化的食物频数问卷调查研究对象过去一年的饮食 情况，尤其是豆类和豆制品的摄入频率和数量。采用三日膳食记录调查对象留尿 前3 日的膳食摄入情况，尤其是豆类和豆制品的摄入量。主要以粮谷类、大豆类、 禽类、鱼类、贝类、肉类、蔬菜水果、奶类和蛋类的摄入量为观察指标。 观察指标及检测常规方法检测身高、体重、腰围、臀围、血压等。H i t a c h i 7 6 0 0 - 0 1 0a u t o m a t i ca n a l y z e
9、r 检测血脂4 项、血糖和尿酸。采用高效液相色谱法检 测尿中大豆异黄酮及其代谢产物。 资料收集和处理E q u o ! 或O D M A 产出者与非产出者之问用s t u d e n t Stt e s t 或者贮t e s t A N O V A 比较两组之间校正年龄之后的体格测量指标、血脂、和尿 酸的差异。所有分析用S P S S 软件( v e r s o n I1 5 ，S P S SI n c ，C h i c a g o ) 进行。 2 大豆异黄酮各成分雌激素活性及其机制研究 ( 1 ) 大豆异黄酮各成分对雌激素依赖性肿瘤细胞M C F 一7 体外及去势裸鼠体内生 长的影响 1 _
10、 ) 大豆异黄酮各成分对雌激素依赖性肿瘤细胞M C F 7 体外生长的影响收集对 数生长期的M C F 7 细胞，在2 4 孔细胞培养板内以2 1 0 4 细胞孔接种细胞，所用 培养基为1 0 0 , 4 血清和1 抗生素的无品红D M E M ，然后分别加入e q u o l 、d a i d z e i n 、 g e i n i s t e i n 、g l y c i t e i n 和17 p - 雌二醇的D M S O 溶液，前4 种设计的剂量系列分别为 0 、0 0 0 1 、0 0 1 、0 1 、1 O 、l O p M ，1 7 p 雌二醇为1 0 - 9 M 进行处理，试
11、验重复3 次，每次3 个平行样。然后置于3 7 ( 2 、5 C 0 2 培养箱中培养9 天，培养基每两 天换一次。采用细胞计数仪S Y S M E XC D A 5 0 0 进行细胞计数，以反映细胞的生 长状况。 2 ) 动物实验 实验动物6 6 只雌性B A L B & 裸鼠，均为3 周龄时行卵巢切除术后的去势裸 鼠，购入后适应性喂养一周后进入试验。 I l l 中山大学博士学位论文大豆异黄酮人体代谢的差异及不同成分雌激素活性的研究 雌二醇的植入在试验动物负荷M C F 一7 细胞前一周，将含1 T m g17 1 3 一雌二 醇的雌二醇片植入实验鼠颈部皮下。 M C F - 7 细胞制备
12、M C F 7 细胞在1 0 0 r a m 的塑料培养皿中于3 7 、5 C 0 2 培养箱中培养，培养液为含有1 0 F B S 和1 抗生素的D M E M 。在细胞植入裸鼠 体内前一周，将细胞培养液换为1 0 F B S 和1 抗生素的无品红D M E M 。 饲料饲料为A 1 N 9 3 G 半纯化基础饲料，其成分符合实验鼠的所有的营养 需要量。饲料中用玉米油代替大豆油以避免任何多余的豆类成分摄入。G e n i s t e i n 组的饲料为A I N - 9 3 G 基础饲料分别加入了2 5 0 m g k g 或1 0 0 0 m g k g 的g e n i s t e i
13、n 。 e q u o l 的两个剂量组分别在饲料中添加S E 5 一O H2 5 0 m g k g ( 以e q u o l 计) 和 S E 5 一O H l 0 0 0 m g k g ( 以e q u o l 计) ，S E 5 O H 是一种通过L g a r v i e a e 发酵大豆而获得 的富含e q u o l 的产品。 负荷裸鼠模型的建立在雌二醇片皮下植入1 周后，在裸鼠背部两侧分别注 射M C F 7 细胞，注射量为2 x1 0 6 细胞0 1 m l 基质胶。 动物分组及处理裸鼠注射M C F 7 细胞两周后，肿瘤平均横断面面积达到 4 6 m m 2 时，将荷瘤裸
14、鼠随机分成六组，其中阴性对照组1 0 只，阳性对照组( 雌二 醇，E 2 ) l1 只，分别进食基础饲料，g e n i s t e i n2 5 0 p p m 组、g e n i s t e i n10 0 0 p p m 组、 S E 5 一O H 2 5 0 p p m ( e q u 0 1 ) 组和S E 5 - O H1 0 0 0 p p m ( e q u 0 1 ) 组各l O 只，分别进入相应 试验组，进食相应试验饲料。除了阳性对照组( 雌二醇，E 2 ) 外，其他组裸鼠皮下 的雌二醇片全部从实验鼠体内移除，以期以雌二醇为对照，观察大豆异黄酮及代 谢产物对裸鼠荷瘤的影响。
15、 试验期间为9 周，每周称量并记录实验鼠的体重及摄食量。每周测量试验鼠 的肿瘤大小。肿瘤横断面面积的计算公式为：【l e n g t h 2 w i d t h 2 丌】。实验结束 时，将实验鼠用乙醚麻醉处死，肿瘤取出称重后置于1 0 的福尔马林中固定，室 温下储存。 ( 2 ) 大豆异黄酮各成分对M C F 7 细胞内E R a 和E R p 蛋白质表达的影响 将M C F - 7 细胞在6 0 m m 细胞培养皿内以3 x 1 0 5 细胞培养皿接种细胞于培养 基为1 0 血清和1 抗生素的无品红D M E M 培养基4 m L 中，分别加入最终浓 中山大学博士学位论文大豆异黄酮人体代谢的
16、差异及不同成分雌激素活性的研究 度为0 、0 0 0 1 、0 0 1 、O 1 、1 0 和l O I t M 的e q u o l 、d a i d z e i n 、g e i n i s t e i n 和g l y c i t e i n 。 然后置于3 7 C 、5 c 0 2 培养箱中培养4 天。采用免疫印迹法测定E R a 和E R p 蛋白质的表达。具体方法如下，通过1 0 S D S P A G E 将得到的细胞裂解产物分 离，然后将蛋白质转移到P V D F 膜上，用5 的脱脂奶粉封闭膜，加入l ：1 0 0 0 的 一次抗体在4 C 孵育过夜。洗膜后，用1 ：2 0 0 0 的二次抗体在室温下孵育l 小时。 采用E C L 检测系统检测E R a 、E R p 和G A P D H 。 ( 3 ) 大豆异黄酮各成分对M C F - 7 细胞内雌激素反应元
