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1、农业生物学实验教学中心 植物总植物总DNADNA的提取的提取 及琼脂糖凝胶电泳检测及琼脂糖凝胶电泳检测 制作人：刘红梅 植物基因组 DNA的提取 琼脂糖凝胶电泳检测 n脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA) n与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在 。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋 白释放出来。 n植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在 于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制 活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体 DNA(ctDNA)。 背景知识 核酸的存在形式 nDNA为白色类似石棉样的纤维状物， RNA的纯品呈 白色粉末或结晶
2、。核酸和核苷酸大都呈酸味。 nDNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于 水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比 游离酸易溶于水。 n在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液 中较稳定。 核酸的理化性质 细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸 基本过程 机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。 细胞破碎 uSDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋 白质之间 常借静电引力或配位键结合, SDS能够破 坏这种价键。 uCTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与 脂膜，使细胞中的DNA-
3、蛋白质复合物释放出来，并 使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。 DNA提取 u 蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 u RNA 常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分 子的RNA。 u 酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩 的材料。 u 多糖 提取液中加1PVP。 DNA纯化（去杂质） 实验材料 新鲜蔬菜叶片(去叶脉) 试剂 2CTAB抽提液 TE 缓冲液(pH=8.0) 氯仿：异戊醇(24:1) 材料与试剂 离心机 水浴锅 研钵 微量移液器 仪器用具 移液器量程的选择 1取 2g 清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加 1/3 药匙石英
4、砂和 4mL 2 倍的 CTAB 提取液，迅速研磨。 2将 1mL 研磨液转入 1.5mL 离心管中，置于65水浴中保 温 20min，其间颠倒混匀23次。破碎细胞 3. 12000r/min 离心 5min，取上清液700L转到另一离心管 中。加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒 混匀。12000r/min，离心 5min。抽提去蛋白 4将上清液移入新的1.5mL离心管内，加 600L异丙醇。颠 倒混匀，可见 DNA 絮状沉淀。沉淀核酸 512000r/min，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置干 燥。 将沉淀回溶于20L TE 缓冲液待测。 操作步骤 1)选取新鲜材料，
5、研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提 液充分混匀； 2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添 加巯基乙醇（25），尽可能选取幼嫩的材料； 3）收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀 再溶解难； 4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采 用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同 时还要避免核酸降解酶类的降解。 注意事项 DNA分子在高于等电 点的PH溶液中带负 电荷，在电场中向 正极移动。在一定 电场强度下，DNA分 子的迁移速度与相 对分子质量的对数 成反比。 电泳原理 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙
6、越小，其分辨能力就越强。 琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)(%)线型线型DNADNA分子的分离范围分子的分离范围 (Kb)(Kb) 0.30.35 56060 0.60.61 12020 0.70.70.80.81010 0.90.90.50.57 7 1.21.20.90.96 6 1.51.50.20.23 3 12.012.00.10.12 2 仪器和试剂 仪器 电泳仪 电泳槽 灌胶模具等 Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） 常用电泳缓冲液 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般 与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用： 增加样品比重，以
7、确保DNA均匀沉入加样孔内。 形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置 。 使样品呈色，使加样操作更方便。 上样缓冲液 溴化乙锭（EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间 ，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的 含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般 5ng。 核酸染色剂 注意事项： EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 DNA分子量标准 不同种类DNA Marker 1.凝胶制备 制备0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加 入 20mL 0.5TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50 -60 时，加入 EB 至终浓度 0.5g/mL。缓慢倒入胶 板，待胶凝固后拔出梳子。 2.加样 取10l DNA样液与 2l 上样 buffeer 混匀， 用微量移液器小心加入样品槽。 3.电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压 为15V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚 兰移动到一定位置，停止电泳。 4.观察拍照 四、操作步骤 p紫外仪上观察电泳带及其位置。 p绘制核酸电泳示意图。 作业 1.结合原理，简述CTAB法分离提 取植物总DNA的基本过程。 2.为了获得高质量的植物总DNA ，在分离提取过程中应注意那 些问题？ What?! How?! 思考
