牛心包脱细胞处理后免疫原性及体内降解规律的研究

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1、四川大学 硕士学位论文 牛心包脱细胞处理后免疫原性及体内降解规律的研究 姓名：肖宗位 申请学位级别：硕士 专业：外科学 指导教师：张尔永 20030509 牛心包脱细胞处理后免疫原性及体内降解规律的研究 牛心包脱细胞处理后免疫原性 及体内降解规律的研究 研究生：肖宗位 导师：张尔永教授 摘要 目的：用胰蛋白酶对牛心包进行脱细胞处理，了解其在脱细胞处理前后 组织学及免疫原性的改变，并用失重率来反映牛心包在体内的降解规律， 探讨其作为组织工程心脏瓣膜支架材料的可行性。 方法：】O 只S D 大鼠分为免疫组9 0 只和降解组1 5 只。免疫组又被分成 新鲜牛心包组、脱细胞处理的牛心包组及空白对照组，

2、每组各3 0 只。牛 心包用O 5 胰蛋白酶处理3 小时，观察其脱细胞前后大体形态和组织学 的改变，并把它们植入大鼠体内，测定大鼠在术后7 天、1 5 天、1 月、2 月、3 月时血清中产生的特异性抗牛心包抗体I g G 、I g M 的O D 值和术后 1 月、2 月、3 月牛心包的失重率。 结果：脱细胞处理后牛心包完全清除了细胞成分，纤维网架结构轻度 松散，但基本保持完整，与新鲜牛心包相比无明显增厚。血清中I g G 含量在术后7 天三组间比较无统计学意义( P O 0 5 ) ，其余各时点间比 “国家自然科学基金资助项目( 5 9 9 7 3 0 1 2 ) 叫川大学临床医学硕士专业学位

3、论文 较差异有显著性( P O 0 5 ) ，在相应时点新鲜牛心包产生的I g G 值比脱细 胞处理的牛心包高，且新鲜牛心包产生的I g G 值在术后2 月达峰值，而 脱细胞处理牛心包产生的I g G 在术后1 月达峰值。血清中I g M 含量在 各时点三组间比较均有统计学意义( P 0 0 5 ) ，O t h e rp o i n t s lO Dv a l u e so fI g Gh a dd i s t i n c t d i f f e r e n c ea m o n gt h et h r e eg r o u p ( P 0 0 5 ) F r e s hb o v i n

4、ep e r i c a r d i u mg r o u p p r o d u c e dm o r eI g Gt h a na c e l l u l a rb o v i n ep e r i c a r d i u mg r o u pd i da tt h es a m e p o i n tT h eI g Gl e v e lo ff r e s hb o v i n ep e r i c a r d i u mg r o u pr e a c h e dt h ep e a k p o s t o p e r a t i v e2 ”m o n t h ，b u ti na

5、 c e l l u l a rb o v i n ep e r i c a r d i u mg r o u pi t sp e a k v a l u ea p p e a r e dp o s t o p e r a t i v e1 ”m o n t h S e r u mO Dv a l u e so fI g Mw e r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a m o n g t h et h r e e g r o u p se v e r yp o i n t ( 0 0 5 ) F r e s h b o v i n

6、e p e r i c a r d i u mg r o u pp r o d u c e dm o r eI g Mt h a na c e l l u l a rb o v i n e p e r i c a r d i u mg r o u p d i da t t h es a m e p o i n t F r e s h a n d a c e l l u l a rb o v i n e p e r i c a r d i u mg r o u p sr e a c h e dI g Mp e a kv a l u ep o s t o p e r a t i v e15 m o

7、 n t ha n d1 5 “ d a yr e s p e c t i v e l y B o t hf l e s h a n da c e l l u l a rb o v i n ep e r i c a r d i a g r a d u a l l y d e g r a d a t e di nv i v o ，b u tn o tc o m p l e t e l yd e g r a d a t e dp o s t o p e r a t i o v e3 t hm o n t h w i t ht h ea c e l l u l a rb o v i n ep e r

8、 i c a r d i u m d e g r a d a t e df a s t e rt h a nf r e s hb o v i n e p e r i c a r d i u m C o n c l u s i o n ： T h ea c e l l u l a r i z a t i o np r o c e d u r er e s u l t si nac o m p l e t er e m o v a l o fc e l l s ，b u tE C Mo fb o v i n e p e r i c a r d i u m r e m a i n s e s s e

9、 n t i a l l yi n t a c t I m m u n o g e n i c i t yo f a c e l l u l a rb o v i n ep e r i c a r d i u md e c r e a s e ，b u ti sn o tr e m o v e d c o m p l e t e l y A c e l l u l a rb o v i n ep e r i c a r d i aa r ed e g r a d a b l eb i o m a t e r i a l s K e yW o r d s ：b o v i n e p e r i

10、 c a r d i u m a c e l l u l a r i m m u n o g e n i c i t y d e g r a d a t i o ni nv i v o 4 牛心包脱细胞处理后免疫原性及体内降解规律的研究 牛心包脱细胞处理后免疫原性 及体内降解规律的研究 研究生：肖宗位 导师：张尔永教授 前言 自从二十世纪中期开始应用人工心脏瓣膜以来，人们一直在致力于 寻找出一种理想的心脏瓣膜置换材料【1 。牛心包作为一种生物材料，常 被制成心脏瓣膜，心血管补片，在心血管外科中已获得广泛应用。以往 常用戊二醛对牛心包中的细胞和间质进行交联预处理，以达到降低免疫 原性、减轻异物反

11、应、稳定胶原基质、增强抗酶解能力以及达到对材料 进行消毒、保存等目的 2 】。尽管这种处理的牛心包在临床上已获得很大 成功，但是其植入体内后易引起钙化、蜕变，还有戊二醛单体对细胞的 毒性作用等f 3 、4 ，这些均影响其耐久性，而且戊二醛处理的牛心包并没有 完全消除其免疫原性，在大鼠体内试验中仍有较强体液免疫反应和细胞 免疫反应 5 l 。尽管人们己用各种措施来减低其钙化、蜕变等并发症【6 】，但 其作用有限。人工心脏瓣膜体内钙化、蜕变以及仍有免疫原性的机制是 复杂的，是多因素造成的，但是材料上的细胞成分与这些并发症之间有 密切关系。研究表明，戊二醛对材料的交联处理仅使其中的细胞破裂溶 解，但

12、很多细胞残片被保留在材料上n 细胞残片上膜相关抗原易引起 宿主免疫反应，加速材料的酶降解【”，而细胞膜上磷脂也与早期钙结晶 四川大学临床医学硕士专业学位论文 形成有密切关系【9 1 。戊二醛处理的材料对细胞有毒性作用，使宿主细胞 无法在材料上生长，以及更新替代蜕变降解的组织( 1 “，这也是造成材料 不能耐久使用的重要因素。近年来，随着组织工程学的兴起，为解决这 些问题提供了一个新的思路和方法。组织工程心脏瓣膜是自身组织心脏 瓣膜的复制品，有良好的流体特性、无免疫问题、不需抗凝，且有再生 能力，使其寿命无限延长，并随病人发育而生长等优点，是理想的心脏 瓣膜置换材料。支架材料是组织工程心脏瓣膜研

13、究的重要内容之一。目 前主要有人工多聚体材料和天然衍生材料二类。人工多聚体材料对种子 细胞粘附能力差1 ，因此一些学者转向对天然衍生材料的研究，特别是 材料脱细胞处理的研究。脱细胞处理就是利用除垢剂和或酶等清除材料 上细胞及可溶性蛋白，而保留了大部分不溶性胶原蛋白和弹性蛋白，且机 械特性无明显改变的支架结构。脱细胞处理的材料不仅免疫原性低，钙 化少，而且材料上对细胞有粘附作用的细胞外基质及独特三维立体结构， 均适合于自体细胞生长，为组织工程法制造人工生物心脏瓣膜提供了一 种良好支架材料。动物实验【”1 也表明其在体内有良好的生物学功能。尽 管脱细胞处理还存在局限性，还有许多问题需要进一步解决，

14、例如，何静 脱细胞处理方法为最佳方案，脱细胞处理的材料远期效果以及与细胞间 相互作用等问题。但这种方法的提出为人工生物心脏瓣膜研制开辟了一 种新的途径。本实验利用胰蛋白酶对细胞间蛋白质水解及细胞离散作用， 对牛心包进行脱细胞处理，了解材料在脱细胞前后免疫原性及组织学改 变，并观察其在体内的降解规律，探讨其作为组织工程心脏瓣膜支架材 料的可行性。 牛心包脱细胞处理后免疫原性投体内降解规律的研究 材料与方法 1 实验动物、设备及试剂 l1 动物选择及分组 健康纯系S D 大鼠( 由四川大学华西基础与法医学院动物实验中心 提供) 1 0 5 只，每只约2 0 0 9 ，分为免疫组9 0 只，降解组1

15、 5 只。免疫组 又分为新鲜心包组、脱细胞处理牛心包组、空白对照组( 以下分别简称 新鲜组、处理组、对照组) 各3 0 只。所有大鼠在整个实验过程均按相同 标准饲养条件喂养。 1 2 检测仪器及检测试剂 D G 3 0 2 2 A 型酶联免疫检测仪 L X J I I 型离心沉淀机 T G 3 2 8 型分析天平 2 K 8 2 A 型真空干燥箱 生物素化的羊抗大鼠I g G ，I g M H R P 标记的兔抗山羊I g G H R P 标记的兔抗山羊I g M u V 7 5 4 紫外分光光度计 国营华东电子管厂 上海医用分析仪器厂 上海精细仪器厂 上海实验仪器总厂 武汉博士德公司 武汉搏

16、士德公司 晶美生物工程有限公司 上海第三光学仪器厂 2 方法： 2 1 牛心包采集、处理及样本制作( 由四川大学高分子材料系提供) 取新鲜屠宰的牛心包，去除周围脂肪组织，立即放入4 。CH a n k s 液 中，随后在室温( 2 5 。C ) 下放入0 5 胰蛋白酶溶液中持续振荡处理3 小 时，再用磷酸盐缓冲液反复多次漂洗清除残余成分。将新鲜牛心包及脱 细胞处理的牛心包制成1 0 X1 0 X O 5 m m 大小试样。 心川大学临床医学硕士专业学位论文 2 2 组织学观察 取新鲜牛心包及脱细胞处理的牛心包行大体形态观察，并把样品放 在甲醛中固定，常规石蜡包埋、切片、H E 染色，观察组织学改变。 23 牛心包大鼠体内植入 用1 0 水合氯醛3 m l k g 经腹腔注射麻醉大白鼠后固定、备皮，做背 部正中切口长约2 c m ，切开皮肤、皮下组织，并向两侧钝性分离。在免 疫实验中，除对照组动物仅做切口未植入心包材料外，其余每