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1、福建爱国第三届海洋生物高技术论坛 2 0 0 5 0 8 19 2 3 日本对虾两种新的C 型凝集素的表达和功能研究 杨海杰罗田李钫徐洵 ( 国家海洋局第三海洋研究所，海洋遗传资源重点实验室，福建厦门3 6 1 0 0 5 ) 对虾病毒性疾病，尤其是W S S V 感染引起的病毒病严重制约了我国水产养殖事业的发 展。对对虾自身抗病因子的研究将有助二_ 推动对虾病毒性疾病的防治工作。现已了解，对虾 缺乏类似哺乳动物的特异性免疫虑答系统，J 它对外来病原微生物的识别和清除主要依靠先天 性免疫庶答。对虾的凝集素，尤其是C 型( C a 离子依赖的) 凝集素，被认为是参与先天性免 疫应答的重要宿土凶子
2、。它可能通过对细菌或病毒外膜上糖基的特异性识别，发挥调理或中 和作用阻断细菌或病毒的感染，进而借助宿主细胞如血细胞清除之。冈此，寻找与抗病毒相 关的凝集素成为我们的研究目标之一。 前期研究中，我们利用S S H 技术从抗病日本对虾肝胰腺文库中分离到两个新的C 型凝集 素基冈，P j 1 e c l 和P j l e c 2 。这两种凝集素在抗病虾体内的表达罱明显高于正常对虾，提示它 们可能参与了宿主I 内抗病毒免疫成答过程。在此，我们利用原核细胞表达了这两种凝集素， | _ j i ：对其生物功能进行了初步研究。 首先我们克隆了这两种凝集素c D N A ， ：在大肠杆菌和毕赤酵母细胞进行了表
3、达尝试。 结果显示，常温诱导大肠杆菌时，这两种凝集素均狱得了高效表达，但主要以包含体形式存 在；乍赤酵。啡则没有明显表达。鉴r 此，我们采用了低温诱导大肠杆菌表达，包括2 2 C 、1 5 。C 和4 。C ，结果仪在4 C 诱导时状得了理想的可溶性表达。接着我4 1 j 希t J 用G S T 亲和柱层析对两 种重组蛋白进行了纯化。S D S P A G E 显示其纯度大+ ：9 0 ，且有少最的_ 聚体存在。 体外凝集试验显示，二者对多种血球均无凝集活性，所试的血球来自人、小鼠、大鼠和 兔。随后我们分析了这两种凝集素对包括对虾致病细菌在内的多种微生物的凝集活性。 结 果显示这两种凝集素对革
4、兰氏阳性细菌和酵母细胞均无凝集活性，但P j 1 e c l 对部分革兰氏阴 性绌菌，如嗜水气单胞菌和溶藻弧菌有凝集活性。其中嗜水气单胞菌是水产养殖动物2 种主 要的暴发性疾病病原之一。相信该发现可为对虾细菌性疾病的防治提供一定帮助。 糖特异 性抑制试验显示P j l e c I 对甘露糖有相对较强的结合能力，但最低抑制浓度为O 5m M ，故不能 判定P i - l e c l 是一种甘露糖特异性凝集素。我们还利用了免疫组化对这两种凝集素进行亚细胞 定位。初步的试验结果显示这两种凝集素定位于细胞膜。接下来我们将利用免疫荧光试验进 一步证实这两种凝集素蛋白的亚细胞定位。 这两种凝集素基I 夭I
5、 均分离自抗病对虾，二J ：是我们打算对其潜在的抗病毒功能进行研究。 由于目前国际上仍没有理想的可用来体外感染试验f 佝对虾细胞的细胞系，我们欲借助昆虫细 胞进行体外抗病毒试验。昆虫细胞系为H i g h F i v e ，用来感染的病毒为野生型苜蓿丫纹夜蛾核 型多角体病毒( A c M N P V ) 。抗病毒效果通过感染2 4 小时后和对照( G S T 蛋白) 相比，病毒多 角体形成数目的减少比率进行评价。这一评价系统已经建立起来，目前我们正在对这两种凝 集素的抗病毒功能进行分析。 4 3 8 福建I 门第三届海洋生钧高技术论坛2 0 0 5 0 8 1 9 2 3 综上所述，我们推测这两种凝集素可能分布于对虾细胞的细胞膜上。这两种细胞膜相关 的凝集素分子可能通过类似中和作用的方式参与了抗病毒过程。目前还不了解W S S V 膜上是 否含有糖蛋白或多糖成分，故这_ 两种凝集素具体的抗病毒机制还有待于进一步研究。 4 3 9
