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1、学位论文使用授权说明 独立进 不合其 作出重 结果由 日 本人完全了解湖北中医学院关于收集、保存、使用学位论文的规定， 即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本；学校有权保存学位论文的印刷 本；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布学位论文的部分或全部内 容。( 保密论文在解密后，遵守此规定) 论文作者签名： 日期：年 目录 中文摘要I A B S T R A C T I I I 中英文缩略词表V 前言。1 第一章鳖甲的研究概况3 一生药学研究j 3 二化学成分研究4 ( 一) 氨基酸。4 ( 二) 微量元素4 ( 三)多糖一5 ( 四) 肽类5 ( 五) 其它成分5 三药理研究j 5 ( 一)
2、 免疫调节作用5 ( 二) 抗肝纤维化作用6 ( 三) 抗肿瘤作用7 ( 四) 预防辐射损伤的作用8 ( 五) 抗疲劳的作用8 ( 六) 对肾小球系膜细胞转化生长因子表达的影响8 ( 七) 抗突变效应9 ( 八) 补血作用：。9 ( 九) 增加骨密度j 9 四临床应用9 ( 一) 治疗肝纤维化及肝硬化9 ( 二) 抗慢性乙型病毒性肝炎1 0 ( 三) 其他1O 第二章鳖甲抗肝纤维化有效物质的研究11 一鳖甲抗肝纤维化的药理试验1 1 ( 一) 试验材料11 ( 二) 供试药物的制备12 ( 三) 试验方法：1 2 ( 四) 试验结果1 3 ( 五) 讨论1 5 二鳖甲抗肝纤维化有效物质部位分离
3、与筛选1 5 ( 一)鳖甲不同分子量物质部位的分离1 5 ( 二)鳖甲抗肝纤维化有效物质部位的筛选16 ( 三) 讨论2 2 三鳖甲抗肝纤维化有效物质组分的分离与筛选2 3 ( 一) 鳖甲抗肝纤维化有效物质部位的组分分离2 3 ( 二) 鳖甲抗肝纤维化有效组分的筛选2 4 ( 三) 讨论2 7 四鳖甲抗肝纤维化有效组分的跟踪分离与筛选2 7 ( 一) B j 6 有效组分的分离2 7 ( 二) 鳖甲抗肝纤维化有效小组分的筛选2 8 ( 三) 讨论41 第三章鳖甲抗肝纤维化有效成分的筛选及结构鉴定4 2 一鳖甲抗肝纤维化有效成分的分离4 2 ( 一) 鳖甲抗肝纤维化有效小组分B i 6 1 1
4、的分离纯化4 2 ( 二) 鳖甲抗肝纤维化有效小组分B j 6 1 2 、B j 6 1 3 的分离纯化4 3 二 鳖甲抗肝纤维化有效成分的筛选4 4 ( 一) M T T 比色法测定1 - 9 各成分对H S C 细胞增殖的影响。4 4 ( 二) 酶联免疫吸附剂测定法检测1 - 9 各成分对肝星状细胞活化、 胶原合成的影响4 7 三 鳖甲抗肝纤维化有效成分的结构鉴定5 3 ( 一) 仪器5 3 ( 二) 试验方法5 3 ( 三) 试验结果5 3 四讨论5 3 第四章鳖甲抗肝纤维化活性成分作用机理研究5 7 一试验材料与仪器5 7 二 试验方法5 7 ( 一) H S C 的培养5 7 ( 二
5、) 药物处理5 8 ( 三) W e s t e r n b l o t 检测。5 8 三试验结果6 0 四讨论6 4 结语与创新6 7 参考文献6 8 攻博期间已发表和待发表的文章7 4 致谢：7 5 中文摘要 鳖甲为药食两用传统中药，来源于鳖科动物鳖( T r i o n y x s i n e n s i s W i e g m a n n ) 的背甲，具有滋阴潜阳，软坚散结，退热除蒸的功效；主治 阴虚发热，瘢瘕，虚风内动等病症。现代药理学研究表明，鳖甲提取物显 示了较强的抗肝纤维化作用；据文献报道，以鳖甲为君药的复方制剂治疗 肝纤维化疾患，临床疗效良好。 为了诠释鳖甲抗肝纤维化的物质基
6、础，本论文在中医药理论指导下， 通过多学科交叉的研究方法，采用超声提取方法和膜透析分离技术将鳖甲 提取物分为不同分子量范围的物质部位，通过其对肝星状细胞增殖的影响 及其对肝星状细胞活化、胶原合成的影响等活性筛选方法，确定了分子量 小于6 0 0 0 的鳖甲提取物为抗肝纤维化有效物质部位。采用现代色谱分离 技术，通过葡聚糖凝胶S e p h a d e xG 2 5 将鳖甲有效物质部位分离为8 个分 子量段的肽类物质组分( B j1 B j 8 ) ，药理筛选得到3 个分子量段肽类物质 组分具有抗肝纤维化活性( B j 4 、B j 6 、B j 7 ) ；选择活性较强的B j 6 分子量 段进
7、一步通过葡聚糖凝胶S e p h a d e xG 1 5 将B j 6 分离为1 6 个肽类物质小 组分，结合四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法( M T T 比色法) 和酶联免 疫吸附剂测定( E L I S A ) 活性筛选，确定了3 个活性较强的肽类物质小组 分( B j 6 1 1 、B i 6 1 2 、B j 6 1 3 ) ；采用制备高效液相色谱分离方法，从这三 个活性较强的肽类物质小组分中分离得到9 个肽类成分，药理筛选表明成 分2 和成分4 具有较强抗肝纤维化作用。 采用4 7 0 0 串联飞行时间质谱仪 4 7 0 0P r o t e o m i c sA n a l y
8、z e r ( T O F T O F T M ) ( A p p l i e dB i o s y s t e m s ，U S A ) ，对两种肽类成分进行结构分 析，测定结果为：成分2 ：分子量为10 4 0 5 7 ，氨基酸排序为wLY PG NTSC ( f r p L e u T r y P r o G l y A s n 。T h r - S e r - C y s ) ：成分4 ：分子量为 5 8 3 2 9 9 ，氨基酸排序为YS G A W ( T r y S e r G l y A l a T r p ) ；经N C B I 检索，以上两个肽类化合物均为首次从天然界中分离
9、得到。 通过免疫印迹法( W e s t e r n b l o t ) ，从上述抗肝纤维化肽类物质中选 择活性较好的化合物“YSG Aw 进行了抗肝纤维化作用机理研究。研 究结果表明，该肽类是通过减少S m a d 3 蛋白的磷酸化，减少细胞外基质 ( E C M ) 等基因的转录；同时，通过增强基质金属蛋白酶一1 ( M M P 1 ) 的活性和降低金属蛋白酶组织抑制因子一1 ( T I M P 1 ) 的活性，使降解的 E C M 增多，从而达到抗肝纤维化的目的。 主题词：鳖甲：肝纤维化；M T T ：E LlS A ：W e s t e r n - bIo t S t u d yo n
10、t h ed r u ge f f e c ts u b s t a n c e sa n dt h em e c h a n is mo f a n ti - h e p a tjCfib r o siSe f f e c t so fC a r a p a xT r i o n y c i s S p e c iaIit y ：T r a ditio n aIC hin e s eP h a r m a c o lo g y A u t h o r ：T a n gY in pin g T u t o r ：P r o f L i UY a n w e n A B S T R A C T
11、C 臼r 印似T r i o n y c i s ，a sb o t ht r a d i t i o n a lC h i n e s em e d i c i n ea n df o o d ，d e r i v e d f r o mt h es h e l lo fT r i o n y xs i n e n s i sW i e g m a n n I th a ss u c h e f f e c t sa s r e p l e n i s h i n g y i n ，r e s t r a i n i n g y a n g ，s o f t e n i n g a n d
12、r e s o l v i n g h a r d m a s s e s ，r e d u c i n gf e v e ra n dr e m o v i n gs t e a m ；I ti su s e df o ra n t i f e v e r ，a b d o m i n a l m a s s ，w i n d ys y n d r o m ea g e n t s M o d e mp h a r m a c o l o g i c a lr e s e a r c h e s r e v e a l e d t h a te x t r a c t so fC a r a p a xT r i o
