发酵技术 第二章 菌种的选育、保藏与培养1综述

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1、第二节 工业微生物 菌种的选育和鉴定 2.1 工业常用微生物常用菌种 （一）细菌（bacteria） 醋杆菌属（Acetobacter） 乳杆菌属（Lactobacillus） 芽孢杆菌属（Bacillus） 短杆菌属（Brevibacterium） 棒杆菌属（Corynebacterium） (1) 细 菌 的 结 构 （二）酵母（yeast） 1.酵母属（Saccharomyces） 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 2. 假丝酵母属（Candida） 产朊假丝酵母（Candida utilis ） 3. 毕赤酵母属（Pichia） 酵母的菌落 （三）霉菌（mo

2、uld） 霉菌的菌落 霉菌孢子结构 （四）放线菌actinomyces） 最大的经济价值在于产生多种抗生素(antibiotic) (1)放线菌的形态 (2)放线菌的结构 气生菌丝气生菌丝 孢子丝孢子丝 孢子孢子 基内基内菌丝菌丝培养基培养基 菌种获得渠道 从菌种保藏机构直接购买所 需的菌株 从自然界或现有菌种中分离 筛选菌种 从筛选出的菌种进行改良从 而获得新菌种 国内菌种保藏机 构 1 1）普通微生物菌种保藏中心：中科院微生物研究所）普通微生物菌种保藏中心：中科院微生物研究所 2 2）农业微生物保藏管理中心：中国农科院）农业微生物保藏管理中心：中国农科院 3 3）工业微生物保藏管理中心：中

3、国食品发酵工业研究院）工业微生物保藏管理中心：中国食品发酵工业研究院 4 4）医药微生物保藏管理中心：）医药微生物保藏管理中心： 5 5）兽医微生物保藏管理中心：农业部兽医微生物研究所）兽医微生物保藏管理中心：农业部兽医微生物研究所 6 6）CCTCC: Chinese Centre for Type Cultures Collections, CCTCC: Chinese Centre for Type Cultures Collections, Wuhan University, Wuhan, Hubei, 430072, China.Wuhan University, Wuhan, Hu

4、bei, 430072, China. a. a. 细菌：卫生部细菌：卫生部 b.b. 真菌：中国医科院皮肤病研究所（南京）真菌：中国医科院皮肤病研究所（南京） c. c. 病毒：中国医科院病毒所病毒：中国医科院病毒所 d.d. 新抗生素：四川抗生素工业研究所新抗生素：四川抗生素工业研究所 e. e. 生产用抗生素：华北制药厂生产用抗生素：华北制药厂 1 1）美国典型菌种收藏馆（）美国典型菌种收藏馆（ATCCATCC） 2 2）美国农业研究服务处菌种收藏馆）美国农业研究服务处菌种收藏馆 3 3）英国国立标准菌种贮藏所：）英国国立标准菌种贮藏所： 4 4）法国巴斯德研究所：教学科研免费）法国巴斯

5、德研究所：教学科研免费 5 5）德国微生物和细胞收藏所）德国微生物和细胞收藏所 6 6）日本微生物菌种保藏联合会（）日本微生物菌种保藏联合会（JFCCJFCC） 国外菌种保藏机构 不承担鉴定业务，工业菌种收费保藏，教学科研菌种免费供应不承担鉴定业务，工业菌种收费保藏，教学科研菌种免费供应 不收集不能形成冻干保存的菌种不收集不能形成冻干保存的菌种 2.2菌种选育 菌种选育工作大幅度提高了微生物发 酵的产量，促进了微生物发酵工业的 迅速发展。 通过菌种选育，抗生素、氨基酸、维 生素、药用酶等产物的发酵产量提高 了几十倍、几百倍、甚至几千倍。 菌种选育在提高产品质量、增加品种 、改善工艺条件和产生菌

6、的遗传学研 究等方面也发挥了重大作用。 菌种选育的目的是改良菌种的特性， 使其符合工业生产的要求。 一、自然选育 在生产过程中，不经过人工诱变 处理，根据菌种的自发突变而进 行菌种筛选的过程，叫做自然选 育。 自然选育： 从自然界分离获得菌株 根据菌种的自发突变进行筛选而获 得菌种。 1. 从自然界分离获得菌株 采样 增殖培养 纯种分离及纯培养 生产性能测定 u定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生 长培养特性。 u采样：有针对性地采集样品。 u增殖培养：人为地通过控制养分或培养条件， 使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 u纯种分离及纯培养：利用分离技术得到纯种。 u生产性能测定：进行生

7、产性能测定。 这些特性包括形态、培养特征、营养要求 、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、 耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值 、提取工艺等。 菌种筛选主要步骤： 调查研究及查阅充分的资料 设计实验方案 确定采集样品 的生态环境 采样 确定特定的增 殖条件 增殖培养 确定特殊的选 择培养基及可能的 定性或半定量 快速检出法 平板分离 原种斜面 确定发酵培养基础条件 筛选 初筛（1株1瓶） 复筛（1株35瓶） 结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株35瓶） 35株 单株纯种分离 生产性能试验 毒性试验 菌种鉴定 （一）采样 1、采样地点 以采集土壤为主。包括极端环境中的微生物类群 。

8、u一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为 主； 富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多 ，如 一些野果生长区和果园内。 u采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。 从自然界筛选 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土 ，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋 或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境 条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型 尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。 （二） 增殖培养 样品含所需菌种较多，可直接分离; 样品含所 需菌种很少，就要设法增加数量(增殖

9、或富集培养) 。 增殖培养: 就是给混合菌群提供一些有利于所 需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件以促使所 需菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。 增殖培养 增殖培养具体措施 控制培养基碳源种类 某 一特定物质为唯一碳源或氮源 控制培养条件 根据目的微 生物的特殊要求进行控制培养 高温、高压 添加某些抑制因子或促进因 子 抗真菌剂、促进因子 往往几种措施并用 增殖培养 例如： 酒精酵母含糖、酒精、低pH 纤维素酶产生菌纤维素唯一碳源 放线菌添加10%酚数滴(抑制霉菌和细菌) . 营养和条件无穷尽的组合可从自然界分离大量的特定 微生物。 抑制剂的使用抑制剂的使用 加入抗真菌试剂（制霉菌素、两性霉素

10、B、放线菌酮、 丙酸钠以及使真菌形成较小菌落的rose bengal等）， 抑制真菌生长； 加入抗细菌抗生素（青霉素、链霉素）抑制细菌生长 ，增加放线菌的分出率； 加入某些抗生素也可抑制部分放线菌，有利于分离到 一定种类的放线菌。如新生霉素有利于分离北里孢菌属 。 实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目） 采样（造纸厂）80度30分钟处理 文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌 0.0075%曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养34天，选择有凹陷圈的菌落。 从285个土样中获得62株 26株为组成型 36株为诱导型 （三） 纯种分离及纯培养 A.增殖

11、培养还不能得到微生物的纯种，生产菌在自 然条件下通常是与各种菌混杂在一起的，所以有必要 进行分离纯化，才能获得纯种。 B.要分离纯化获得纯种,必须将培养物制备成单孢 子或单细胞悬浮液,经适当稀释后在琼脂平板上进行划 线或稀释分离才能得到纯种。 分离培养 要点：制备单孢子悬浮液、适当 稀释、选择培养基上分离 培养条件对筛选结果影响也很大 ，可通过控制营养成分、pH、抑 制剂、温度和通气及热处理等来 提高筛选效率。 分离方法 稀释法 是通过不断地稀释使被分离的样品分散到最 低限度，然后吸取一定量注入平板，使每一微生物都远 离其他微生物而单独生长成为菌落，从而得到纯种。稀 释法在培养基上分离的菌落单

12、一均匀，获得纯种的机率 大，特别适宜于分离具有蔓延性的微生物。 利用选择平板进行直接分离 1.稀释平皿分离法 1.稀释分离法 99ml 1g 9ml 9ml 9ml9ml9ml9ml 1/100 1/1000 10-8 10-710-610-510-4 1ml 1ml1ml1ml 1ml(1)稀 释 1.稀释平皿分离法 b.涂布平皿分离法 a.倾注平皿分离法 分离方法 划线法 单细胞微生物(细菌、酵母菌) 是将含菌样 品在固体培养基表面作有规则的划线(有扇形划线法 、方格划线法及平行划线法等)，菌样经过多次从点 到线的稀释，最后经培养得到单菌落。划线法简单 且较快。 2.划线分离法 a.分区划

13、线分离法 b.连续划线分离法 固体培养基四区划法接种法 A B C D A A B A B C （3）组织分离法 主要用于食用菌菌种或某些植物 病原菌的分离 （四）生产性能的测定 2. 从自发突变体中获得菌株 变异是育种的基础。 在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变 而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。 自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9 自然突变有两种情况： 一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和 生产质量的下降，这种突变成为负突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成 为正突变。 自发突变的频率较低，因此自然选育筛选 出来的菌种，

14、不能满足育种工作的需要。因 而不能仅停留在“选”种，还要进行“育”种。 如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌 种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具 有优良特性的变异菌株诱变育种。 二、微生物菌种的诱变选育 二、微生物菌种的诱变选育二、微生物菌种的诱变选育 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称 为诱变育种. 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂. 诱变剂 物理在：紫外，快中子 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍 1.出发菌株的选择： 出发菌株用来育种处理的起始菌株. .出发菌株应具备： 对诱变剂的敏感性高； 变异幅度大、产量高； 出发菌株的来源； 自然界直接分离到的野生型菌

15、株： 生产中正在使用的菌种： 菌种保藏机构购买： 诱变育种的一般步骤 菌种分离方法 透明圈法 变色圈法 生长圈法 抑菌圈法 二、菌种鉴定 多多 相相 分分 类类类类 分分 子子 分分 类类类类 化化 学学 分分 类类类类 数数 值值值值 分分 类类类类 传传传传 统统统统 分分 类类类类 计算机应用 形态、生理生化特征 细胞壁、 细胞膜组成和结构等 DNA，RNA等 利用微生物 多种不同的 信息，包括 表型的、基 因型的和系 统发育的信 息，综合起 来研究微生 物分类和系 统进化的过 程。 1、经典分类鉴定方法 形态学特征 生理生化特征 血清学试验和噬菌体分型 特征分析方法观观察点 菌体染色反 应应 革兰兰氏染色法G，紫色；G-，红红 色 菌体大小和 形状 光学显显微镜镜，测测微 尺； 透射电镜电镜 菌体排列或分支情况 鞭毛鞭毛染色（银银染法 ）； 透射电镜电镜 有无，着生部位，数 目 芽胞芽胞染色（孔雀绿绿 染色法，简单简单 染色 法等）； 透射电镜电镜 有无