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1、猪的传染瘸 A 组( p c D l 妣旬R F 2 ) 的特异性抗体与B 组( p c D N A 旬R F 2 + I L 2 ) 组的抗体水平差异不 显著( P o 0 5 ) ，并且大小剂量组在消长规律上基本一致。由于I L 2 主要是引起T h l 方向的 细胞因子。所以在体液免疫方面效果不如I L 6 和I L 6 4 佐剂组好。 3 3 猪圈环病毒基园疫苗免疫仔猪细胞免疫情况 p c D N A o R F 2 基因疫苗和各佐剂组免疫仔猪后，T 淋巴细胞亚类c D 3 + 、c D 4 + 、C D 8 + 均表现出不同变化，产生了较强的细胞免疫应答。 大小剂量组的C D 3 +
2、 T 数量与对照组相比升高差异显著( P o 0 5 ) ，c D 3 + 是成熟的T 淋巴 细胞亚群所占的百分率，它的数量增加说明T 淋巴细胞增殖，有报道表明当猪圆环病毒2 型 感染仔猪后c D 3 + T 数量显著降低，并且愈后不良 1 5 】。但在本试验中，所有试验组与对照 组比较c D 3 十T 数量都升高，表明P C V 2D N A 疫苗能激活仔猪的免疫系统提高细胞免疫水平。 佐剂组中。l L - 2 在诱导细胞免疫方面效果明显强于其他各组，在对人类和多种哺乳动物 的研究表明。I L - 2 可以促进T 、B 淋巴细胞的增殖、分化，对自然杀伤细胞( N K ) 、淋巴因子 激活的杀
3、伤细胞( L A K ) 等都有多种促进作用。x i l l 等( 1 9 9 8 ) 【1 6 】发现，I L - 2 真核表达质粒可增 强H I V D N A 疫苗诱导细胞免疫应答的能力。共注射I L 2 质粒可显著增强D N A 疫苗对B 细胞和 T 细胞的增殖分化、促进免疫球蛋白的分泌、提高抗体阳转率和中和抗体的效价、增强特异 性c D 4T 细胞的增殖反应及C D 8 + 细胞毒T 细胞活性等等。 本研究中，我们将3 种细胞园子和p c D N A P C v 2 - o R F 2 基因疫苗共同肌注免瘦仔猪来探 讨其对机体免疫功能的影响，结果表明I b 2 为佐剂的实验组，无论是
4、T 淋巴细胞亚群数量， 还是T 淋巴细胞的转化功能，都显著高于单独注射p c D N A P c v R F 2 基因疫苗实验组 口 o 0 5 ) ，表明细胞因子佐剂I L 2 在仔猪体内得到了表达，并对基因疫苗免疫仔猪的细胞免 疫功能有极显著的促进作用，也表明猪I L 2 可作为佐剂与口c D N A o R F 2 O R F 2 基因疫苗共 同使用来提高D N A 疫苗的免疫效果。6 组效果次之。但也能显著的提高细胞免疫功能。 所以综合考虑到体液和细胞免疫两方面的结果。I L 6 是猪圆环病毒I I 型核酸疫苗的比较 理想的佐剂。 3 4 免疫剂量对基因疫苗免疫效果的髟响 大量研究证实
5、，肌肉注射都能使T h l 和1 1 1 2 辅劲的免疫反应产生，是一种比较好的免疫方 法。然而。肌肉注射途径要求有足够大的剂量。核酸疫苗的剂量是诱导有效免疫应答的一个 重要因素。过少不引起有效的免疫应答。过多浪费疫苗。在本研究中。大剂量组诱导的体液 免疫和细胞免疫应答有高于小剂量组的趋势，表明p c D N A o R F 2 基因疫苗对体液和细胞免疫 功能的诱导具有一定的剂量依赖性，产生理想的免疫应答所要求的核酸疫苗接种量，主要视 不砑注射方法及注射对象而定。本研究结果表明，p c D N A o R f 2 基因疫苗肌肉注射于仔猪。 剂量2 5 0 - 5 0 0 u g 都能诱导仔猪产
6、生良好的体液和细胞免疫应答。 参考文献略 猪2 型圆环病毒核酸疫苗免疫效应研究 柬云峰肖少波，金梅林，张松林，陈焕春 ( 华中农业大学动物匡学院动物传染病擘研究宣，湖北武汉，4 3 0 0 7 0 ) 摘要lP C R 扩增P c v 2 0 R F 2 和B 哩2 基因将O R F 2 基因克隆八真核表达栽体D c D N A 3 ，l ( + ) 构建 了p c o R F 2 作为核酸疫苗免疫小自鼠同时将具有蛋白转导功能的B v P 2 2 基因分剐克隆到O R F 2 基因的上 游和下游，使二着融合表述，命名为p c O R F 2 B v P 2 2 和p c B v P 2 2 0
7、 R F 2 分四组肌肉免疫B a l b ，c 小白鼠， 分别注射p c D N 1 kp c O R F 2 p c 0 R F 2 B v P 2 2 彝p c B v P 2 2 0 R 也，共免疫2 次，间隅2 用，分别于 首免后2 周和二免后4 周采血。E L I s A 法检测体液抗体同时为在体外验证O R F 2 和B v P 2 2 基因的真核表 速，将0 R F 2 和B V P 2 2 基卧分别克隆八p E G F P N I 栽体，构建了p N o R F 2 和p N B v P 2 2 转染H e l a 细胞后 在荧光显微镜下观察到了o R F 2 和B V P
8、2 2 在体外的瞬时高妓表逮实验结果显示，通过两次免疫后，各疫 苗组均产生了针对O R J 毪的体液抗体，同时证明B v P 2 2 可增强橱酸疫苗的免疫效果，其中以B v P 2 2 在O R F 2 上游效果更好本研究为防制猪2 型圃环病毒感染提供了较为理想的侯选疫苗 中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会 猪2 型圆环病毒( P 0 r c i n ec i r c o v i m st y p e2 ，p C v 2 ) 属于环状病毒属。该病毒无囊膜，病 毒粒子直径约为1 5 一1 7 姗基因组为单链环状D N A ，大小约为1 7 K b 主要由两个大的开放 阅读框架组成
9、，0 砌1 编码R e p 蛋白l l I ，与病毒的复制有关。O R F 2 编码核农壳蛋白1 2 l ，是病 毒的主要结构蛋白。P c V 2 可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征( P o s t - w e M i n gM u l t i s y S t e m i c w 如t i n gs ”d m m e ，P M w S ) I j J ，主要症状为生长缓慢，贫血呼吸困难，黄疸等，病理变化 主要为间质性肺炎，淋巴节炎，肝炎，肾病，可导致机体免疫机能下降，造成其它病毒、细 菌性疾病的并发或继发。该病自上世纪9 0 年代爆发以来，在世界各地均有报道。我国郎洪 武等用E L l S A
10、方法进行的流行病学调查显示，P C V 2 抗体阳性率为很高p 】。周继勇等用间接 免疫荧光的方法对浙江省主要养猪地区的血清样品进行分析，发现猪场的感染率为l O o ， 猪群平均感染率为5 8 _ 3 l I ) J 。关于该病疫苗的研究，主要集中在基于O R F 2 基因的新型疫苗 研究上。B l 锄c h a r dP 等用O R F 2 基因的杆状病毒表达产物免疫猪，可使猪产生对P c v 2 的抵 抗力州1 ( a m s 咖p S 等用O R F 2 基因的核酸疫苗免疫小白鼠在首免后6 2 天小白鼠体内可 检测到高水平的体液抗体”J 。尽管该病在我国广泛存在，并给我国畜牧业带来了巨
11、大的经济 损失，但未见关于防制该病疫苗的报道。本文从我实验室分离的P C v 2 豫A 株中扩增得到 O R F 2 基因，并将其克隆至真核表达载体p C D N A 3 1 中，免疫B a l b ，c 小白鼠，E L I s A 检 测抗体显示特异性体液抗体明显对照组。 牛1 型疱疹病毒E 呓基因( B 0 v i n ch e r p e s v i n B1 ) 2 2 ，B v P 2 2 ) 由2 5 8 个氨基酸组成， H a m s 等通过瞬时表达B ，2 2 - E G F P 融合蛋白发现B v P 2 2 具有蛋白转导功能，并且转导能 力比H S v 1v P 2 2 (
12、 H V P 2 2 ) 更强。D e r 盯等证明v P 2 2 融合蛋白可在转染细胞与未转染细 胞之间传递，并可在高度分化的肌肉细胞中转导这一结果为通过蛋白转导来提高核酸疫苗 的效果提供了理论依据唧。0 1 v e a 等构建了B v P 2 2 、盯P 融合表达的D N A 疫苗，免疫小白 鼠的结果显示特异性体液免疫和特异性细胞免疫都得到了增强l l “。本研究在构建P C v 2 O 砌毪核酸疫苗的同时，构建了B v P 2 2 与O R F 2 融合表达的核酸疫苗，并且使B v P 2 2 基因 分别位于O R F 2 基因的上游和下游，免疫小白鼠的结果显示B v P 2 2 确实可
13、起到免疫增强作 用。 1 材料 t 1 质粒、菌株和细胞 p M D l 8 一T 载体购自宝生物( 大连) 公司；真核表达载体p c D N A 3 1 ( + ) 购自I n “n 嘲e n 公司；含有c M V 启动子，表达增强绿色荧光蛋白的质粒p E G F P - N l ，购自B DB i o s c i e n c e s C l o n t e c h 公司；原核表达P C V 2 0 R F 2 融合蛋白的质粒口G E x O I 强2 由本实验室构建井保存】； 感受态细胞大肠杆菌( E s c h e r i c I l i a c o I i ) D H 5 、B L 2
14、 l 、真核细胞H e l a 细胞均由本实验室保存。 1 2 生化试剂 限制性内切酶、T 4 D N A 连接酶、碱性磷酸酶均购自宝生物( 大连) 公司：7 幻D N A 聚 合酶购自B I O s T A R 公司 转染用脂质体购自I n 眦i g e n 公司：D N A 胶回收试剂盒购自上海 生工公司。 1 3 P c R 引物 用于扩增P C V 2O 砌2 及B v P 2 2 基因的引物如表l 所示。所有引物均由上海生工公司 台成。 2 方法 2 1 P C R 扩增O 啪及B 、1 P 2 2 基因 用P l 和P 2 ，P 3 和P 4 。P l 和P 5 分别扩增O m 鼍
15、基因，P C R 反应程序均为：9 5 预变 性5 m i n ；9 4 变性lm i n ，5 5 退火l m i n 7 2 延伸1 m i n 3 5 个循环后。7 2 延伸1 0 m i n 。 用P b l 和P b 2 。P b 3 和P b 4 分别扩增B v P 2 2 P C R 反应程序为：9 5 预变性5 m i n ：9 4 变 性1 m i n ，6 0 退火l m i n ，7 2 延伸1 m i n ，3 5 个循环后，7 2 延伸1 0 m i n 。P c R 反应结束 后O 8 的琼脂糖凝胶电泳，按D N A 胶回收试剂盒的操作说明回收P c R 产物，并与
16、T 载体 连接，送宝生物( 大连) 公司测序。 3 8 3 猪的传染病 襄1 用于扩增P c V 2 0 R 】 2 豆B v P 2 2 基因的引物序列及酶切位点 旦! 坦! ：! ! 竺竺盟! 塑堡! ! 也! 鉴丝Q ! 丝竺! ! ! 竺垫 引物名称引物序列酶切位点 2 2 核酸疫苗载体的构建 2 2 1p c o 腑的构建 将O 砌恐基因用B 西I I 和E c o R V 从T 载体上切下，与经B 锄HI 和E c o R V 酶切的 p C D N A 3 1 ( + ) 载体连接，用H i n d 和E c o R V 酶切鉴定，挑取阳性重组子，命名为p c O R F 2 。 2 2 2p c o 砌毪B 恐2 的构建 将B v P 2 2 基因用B 锄H I 和E c o R I 从T 载体上切下，与B a l l l H I 和E c o R I 酶切的
