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1、犬乳腺肿瘤细胞系的建立与生物学特性分析 娆华。林德贵1 母，乔富强1 ，田克恭曾振 ( I 中国农业大学动物医学院。北京1 0 0 0 9 4s2 北京农学院，北京1 0 2 2 0 6 ；3 农业部兽医诊断中心，北京1 0 0 0 9 4 ) 麓要：本试验选取新鲜肿瘤组织，采用组织块直接培养和酶消化法建立了原代犬乳腺肿瘤细胞系细胞 生长动态学观察表明：消化法培养细胞生长符合“s ”形生长曲线，倍增时间为6 4 6 6 h ，细胞经多次传代 之后形态无显著差异；经冻存前和复苏后细胞活率检测，结果均在9 0 以上；染色体核型分析显示二倍体 占主体，众数2 n - 7 4 ，第3 8 对染色体争X
2、 、Y 染色体缺失；细胞免疫化学分析及异体动物移植试验，。结果 星示：细胞p 6 3 ，C a l p o n i n 3 4BE - 1 2 ，E - c a d h e r i n ，V E G F 五种抗体阳性反应，并能够使B A L B c 小鼠致 瘤。致瘤率4 0 ，证实此肿瘤细胞系为腺肌上皮瘤细胞 关冀词：犬乳腺肿瘤( C g T ) ；细胞系；电镜( 己M ) ；染色体 E s t a b l i s h m e n to fC a n l n eM a m m a r yT u m o rC e l ll i n ea n dA n a l y s i so fB i o l
3、o g i c a lC h a r a c t e r i s t i c s Y a o H u a x 。L i nD e g u i I 。Q i a oF u q i a n g z ，T i mK e g o n 9 3 ，C a oZ h e n 3 ( 1 C o l l e g eo f V e t e r i n a r ya n dM e d i c i n e ，C h i n a A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y , B e i j i n g1 0 0 0 9 4 ；2 B e i j i n gU n i v 啪
4、i t yo f A g r i c u l t u r e ，B e i j i n g ，1 0 2 2 0 6 ；3 N a t i o n a lV e t e r i n a r yD i a g n o s i sC e n t e r , B e i j i n g1 0 0 0 9 4 ) A b s t r a c t ：T h ef r e s hU l m o rt i s s u ew a sc u l t u r e db yp r 虹l a 巧e x p l a n t st e c h n i q u eo rb ye n z y m e - d i g e s
5、t i o n C a n i n e m a m m a r yU l m o rc e l lw e 砖s e p a r a t e db yt r y p s i n i z a t i o na n dt h r e et i m e ss u b c u l t u r i n g M o r p h o l o g ya n da n a l y s i so f d y n a n l i cg r o w t hs h o w e dt h a te n z y m e - d i g e s t i o nW a sab e t t e rm e nt oc u l t u
6、 r e 面m a r yt 3 1 m o rc e l l s ；t h e r ew e r en O m o r p h o l o g i c a ld i f f e r e n c ei nc e l I sc u l t u r e ds o m ep a s s a g e sa n dt h ep o p u l a t i o nd o u b l i n gt i m eo fc e l l sw a s6 4 6 6 h T h e v i a b i l i t ye x a n i r n a t i o ns h o w e dt h a tt h ev i a
7、 b l er a t e sw e r eo v e r9 0 w h e t h e rb e f o r ef r e e z i n go ra f t e rm c o v e r y T h ea n a l y s i so fc h r o m o s o m ek a r y o t y p es h o w e dt h ef r e q u e n c yo fc e l lc h r o m o s o m en u m b e rt ob e2 n = 7 4 ，a n dl e s s t h a nt h en o r m a lc a n i n eb o d
8、yc e l l2 n = 7 8 T h ec e l l sc o u l db ep o s i t i v ee x p r e s s i o nw i t ht h em o n o c l o n a la n t i b o d yo f p 6 3 ，C a l p o r f i n , 3 4 p E l 2 、E - c a d h e r i na n dV E G F , a n dc o u l da r i s et u I Y l o ri nB A L B cm i c e ，a n dt h et u m o r i g e n e s i sr a t
9、e w a s4 0 T h e s er e s u l t sp r o v e dt h a tt h ec e l ll i n ew a sc a n i n ea d e n o m y o e p i t h e l i o m ac e l l K e yw o r d s ：c a n i n em a m m a r yt u m o r ( C M D ；c e l ll i n e ；e l e c t r o nm i c r o s c o p y 正M ) ；c h r o m o s o m e 犬的乳腺肿瘤病例是兽医临床较为常见的肿瘤疾病之一，约占母犬肿瘤疾病
10、的1 2 m ，严重影响患犬 生活质量。因此，对兽医临床自然发生的犬乳腺肿瘤病例进行实验室研究，确诊其病理组织学分类，同时 进行细胞学和分子生物学方面的探讨，建立犬乳腺肿瘤细胞系并对其生物学特性予以分析具有十分重要的 理论和临床实践指导意义。本实验利用犬乳腺肿瘤实体组织，采用组织块法和酶消化法进行原代犬乳腺肿 瘤细胞的培养，便于了解细胞的生物学特性，并能够为临床筛选抗癌药物提供细胞基础。 1 材料 1 1 实验动物 a 选用兽医临床经病史调查、临床症状观察、初步诊断为乳腺肿瘤的患犬，主人同意进行外科手术治疗 而未发现有其它疾病的忠犬作为实验动物。 1 2 试剂 细胞培养基、秋水仙素选用S i
11、g m a 公司产品，胎牛血清采用H y c l o n e 公司产品；细胞免疫组织化学试 剂采用北京中杉金桥生物技术公司产品：单克隆抗体p 6 3 ，C a l p o n i n ，( Z M - 0 0 6 9 ) ，S P 试剂盒和D A B 显色 试剂盒。 、 武汉华中农业大学2 0 0 6 1 0 _ l _ _ I _ - l _ l _ _ _ I I II II I I - _ l - l l _ - - _ I _ _ - - - 2 方法 2 1 犬乳腺肿瘤细胞系的建立 采用兽医临床上无菌外科手术摘除的犬乳腺肿瘤组织，去除脂肪组织和残留血迹后进行原代细胞培 养。具体方法(
12、 参阅一般细胞原代培养方法嘲) 如下： 1 ) 外科手术无菌摘除乳腺肿瘤样本，迅速送往细胞培养实验室； 2 ) 无菌超净工作台内，将组织放置于一次性培养皿内，使用D M E M 培养液清洗3 次； 3 ) 使用消毒后的镊子和剪刀，将肿瘤组织切割呈l m m 左右的组织块； 4 ) 在培养皿内加入含高糖、1 0 0 万U m L 青霉素和1 0 0 弘g m L 链霉素的D M 烈培养基，振荡I m i n ，转入 1 5 m L 离心管中； 5 ) 1 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，上清转入细胞培养瓶中； 6 ) 离心后的沉淀再次加入D M E M 混匀、离心，这个过程重复3
13、次； 7 ) 1 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃上清； 8 ) 离心管中加入D M 肼培养基，将沉淀混匀后转入细胞培养瓶中，3 7 5 C Q 条件下进行培养，3 4 天后首次加入l O 的胎牛血清； ； 9 ) 细胞7 0 - - - 8 0 融合后，使用胰酶- E D T A 消化液消化细胞进行5 7 代左右的纯化； 1 0 ) 细胞状态稳定时进行传代、冻存和试验。 2 2 犬乳腺肿瘤细胞的免疫组织化学检测 选取稳定传代的犬乳腺肿瘤细胞，经胰酶一E D T A 消化后，8 0 0 r p m 离心5 m i n ，使用P B S 缓冲液( p H = 7 3 ) 冲洗3
14、次，滴加到洁净的免疫组织化学载玻片孔中，自然风干。 1 ) 分别加入单克隆抗体覆盖金孔，置载玻片于湿盒中3 7 温箱孵育l h 2 ) 取出玻片，使用P B S 缓冲液冲洗3 次5 m i n ； 3 ) 将玻片使用吹风机吹干，加入辣根过氧化物酶二抗，置湿盒中3 7 温箱孵育1 h ： 4 ) 取出玻片，使用P B S 缓冲液冲洗3 次X 5 m i n ； 5 ) 使用D A B 染色剂染色l O m i n ，流水冲洗，显微镜下进行结果观察。 2 3 细胞的电镜观察 电镜观察细胞的形态，可以在很大的倍数条件下清楚地看到细胞的形态。具体步骤是： 1 ) 取洁净的盖玻片，经酒精浸泡后，无菌条件
15、下放入洁净的6 孔细胞培养板中； 2 ) 选取稳定传代的犬乳腺肿瘤细胞，胰酶一E D T A 消化后转移至放入玻片的培养板孔中； 3 ) 每日观察细胞在培养板中的生长状况进行记录； 4 ) 细胞基本在玻片上扩增成单层时，无菌取出玻片： 5 ) 使用P B S 缓冲液清洗3 次，放入电镜前处理盒中，加入戊二醛溶液进行固定。 经一系列电镜前处理过程，干燥后使用电镜进行观察。 2 4 染色体分析 选取已经稳定传代的犬乳腺肿瘤细胞系细胞，细胞处于对数生长期较佳，进行染色体显示，方法和步 骤嘲如下： 1 ) 制成细胞悬液，接种于2 5 m L 细胞培养瓶中，转入C 0 2 培养箱中培养4 8 5 0 h
16、 ； 2 ) 在细胞培养液中加入秋水彳0 l 素，使终浓度达0 2 - - 0 8 t l g m L ，继续培养4 6 h ： 3 ) 用吸管轻轻吹打分裂相细胞，移入l O m L 离心管中，1 0 0 0 r p m 离心l O m i n ，弃上清； 4 ) 逐滴加入0 。5 m L O 0 7 5 m o l L K C l 混匀，后加至5 - - 一1 0 m L ，吹打均匀，3 7 孵育2 0 m i m 5 ) 加入I m L 新鲜固定液( 甲醇：冰醋酸- - - - 3 ：1 ) ；1 0 0 0 r p m 离心l O m i n ，弃去上清； 6 ) 缓慢加入固定液5 - - - l O m L ，用吹管吹打均匀，固定1 5 2 0 m i n ，离心，弃上清； 7 ) 以上过程重复3 次，最后加入5 m L 固定液混匀； 今国兽医外科学第1 3 次学术研讨会小动物医学第1 次学术研讨会暨奶牛疾病第3 次学术
