《拟南芥质膜定位的4个推测的钙调素结合蛋白的分析验证》由会员分享，可在线阅读，更多相关《拟南芥质膜定位的4个推测的钙调素结合蛋白的分析验证（53页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、河北师范大学 硕士学位论文 拟南芥质膜定位的4个推测的钙调素结合蛋白的分析验证 姓名：牛玉强 申请学位级别：硕士 专业：细胞生物学 指导教师：崔素娟 20080610 摘要 在植物中，我们实验室和其他实验室的研究结果表明，钙调索( c a l m o d u li n ， C a M ) ，这一类传统上被认为细胞内重要的C a 2 + 传感蛋白，在细胞外也是广泛存在 的，并且发挥着非常重要的生物学功能。根据这些实验结果，我们实验室提出了 细胞外钙调素可能是种檬物多肽信使酶观点，并且建立了纲胞外钙调素信号转 导机制的假设模型。依据该模型，细胞处钙调素与存在于细胞外或质膜上的受体 结合，进而激活下
2、游信号通路，最终调节植物的生理功能及基因表达。最近，C u i 等人利用3 5 S 标记C a M 的方法，证明了拟南芥悬浮培养细胞和原生质体表面存在 着细胞外C a M 受体样结合蛋白。但是，细胞质膜上与钙调素结合的蛋白是什么， 我们并不清楚，为此，我们进行了以下的实验来研究拟南芥细胞膜上和钙调素结 合的蛋自质。 我室前期工作首先提取了拟涛芥悬浮培养细胞的微粒体膜蛋自，其次利用钙 调素亲和层析及质谱分析，从抽提蛋自中，纯化鉴定褥到了3 5 种蛋自，并且通 过生物信息学分析的方法，对这些蛋白质的性质进行了简单的描述，然后瞬时转 化洋葱表皮细胞，荧光显微镜观察表明，其中有5 种蛋白质在质膜有明显
3、的分布。 但是，这些蛋白质在植物体内是否和钙调素结合，还需要通过其他实验手段 来迸一步证明。为此本实验首先利用酵母双杂交和荧光共振能量转移的技术对这 些候选蛋盘和钙调素的相互作用进行了进一步的验证。酵母双杂交结果表明，4 个候选蛋白质P C a M B P I 、P C a 蠹I B P 2 、P C a M B P 3 、P C 酬B p _ 哇都可以和钙调素发生耀 互作用。但是采用洋葱表皮细胞瞬时共表达系统，荧光共振能量转移分析，只证 实其中的P C a M B P 4 可以和钙调素结合。 另外，本实验还对一些拟南芥T - D N A 插入突变体进行了D N A 水平的初步筛选。 关键字：
4、拟南芥细胞膜钙调素钙调素结合蛋自 A b s t r a c t I np l a n ts y s t e m s ，as e r i e so fw o r ki no u ra n do t h e rl a b o r a t o r y sh a sp r o v i d e d e v i d e n c e st h a tC a l m o d u l i n ( C A M ) ，w d l - k n o w na sa ni n t r a c d l u l a rc a l c i u ms e n s o r , h a s a l s ob e e nf o u
5、n de x t r a c e l l u l a r l ya n dp l a ys e v e r a li m p o r t a n tb i o l o g i c a lr o l e s B a s e dO i l t h e s ed a t a , o u rl a b o r a t o r ys u g g e s t e dt h a te x t r a c e l l u l a rC a Mm i g h ta c ta sap o l y p e p t i d e s i g n a la n dt h e r eW a sap o s s i b l
6、et r a n s m e m b r a n es i g n a l i n gm e c h a n i s m I nt h i sm o d e l ， t h ee x t r a c e l l u l a rC 曲娃b i n d st oi t sr e c e p t o r ( o rr e c e p t o r s ) i ne e l lm e m b r a n ea n dt h e n t h e r e c e p t o r ( o rr e c e p t o r s ) a c t i v a t e s d o w n s t r e a ms i
7、 g n a lp a t h w a yt o r e g u l a t e p h y s i o l o g i c a lr e a c t i o n sa sw e l la sg e n ee x p r e s s i o n C u ie ta f i r s t l yr e p o r t e dt h e p r e s e n c eo fa p o p l a s t i cC a Mr e c e p t o r - l i k eb i n d i n gp r o t e i n so nt h ec e l l s u r f a c eo f A r a
8、 b i d o p s i ss u s p e n s i o n - c u l t u r e dc e l l s 。H o w e v e r , w eh a v e n o ti n d e n t i f i e dt h e c a n d i d a t er e c e p t o r ( o rr e c e p t o r s ) o nc e l ls u r f a c ef o ra p o p l a s tC a M S ow ec o n d u c t e d t h ee x p e r i m e n t sb e l o wt os t u d
9、yt h eC a M - b i n d i n gp r o t e o m i c si nA r a b i d o p s i sc e l l m e m b r a n e s W ep r e v i o u s l yp u r i f i e dt h em i c r o s o m ef r a c t i o n so fA r a b i d o p s i s s u s p e n s i o n c u l t u r e dc e l l s ，a n d t h ep r o t e i n sp u r i f i e df r o mC a Ma f
10、f i n i t y c h r o m a t o g r a p h yw e r ei d e n t i f i e db yL C M S M So rM A L D I - T O F - M S T h e c h a r a c t e r i z a t i o no ft h et o t a l3 5m a t c h e dp r o t e i n sw a sa n a l y z e db yb i o i n f o r m a t i c p r e d i c t i o n U n d e rl a s e rc o n f o e a lm i c r
11、 o s c o p y , f i v ep r o t e i n ss p e c i f i c a l l yo rm o s t l y l o c a t ei no n i o ne p i d e r m a lc e l lp l a s m am e m b r a n eb yt r a n s i e n te x p r e s s i o n A n dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h e s ep r o t e i n sa n dC a M nv v on e e dt ob ef u r t h e r
12、c o n f i r m e d 晰mo t h e rm e t h o d s M a t i n g - b a s e dS p l i tu b i q u i t i ns y s t e m ( m b S U S ) a n d F l u o r e s c e n c eR e s o n a n c eE n e r g yT r a n s f e r ( F R E T ) w e r eu s e dt oi d e n t i f yt h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nC a Ma n di t sp u t a t
13、i v eb i n d i n gp r o t e i n s U s i n gm b S U Ss y s t e m , f o u rp r o t e i n s ( P C a M B P1 ，P C a M B P 2 ，P C a M B P 3 ，P C a M B P 4 ) c o u l di n t e r a c tw i t h C a M B u to n l yP C a M B P 4c o u l di n t e r a c tw i t hC a Mi nt r a n s i e n tC O e x p r e s s i o no n i o
14、 n e p i d n a lc e l lb yF R E Ta s s a y I nt h i sp a p e r , o l l eT - D N Ai n s e r t i o nm u t a n tW a si d e n t i f i e d 。i nD N Al e v e l 。 I d e n t i f i c a t i o no fo t h e ri n s e r t i o nm u t a n t sW a so ng o i n g K e yw o r d s ：A r a b i d o p s i st h a l i a n a c e i
15、 lm e m b r a n eC a MC a M B P s V 缩写表 A t C a M 3 ：A r a b i d o p s i s t h a l i a n aC a l m o d u l i ni s o f o r m3 B i F C ：B i m o l e e u l a rF l u o r e s c e n c eC o m p l e m e n t a t i o n C a M ：C a l m o d u l i n C A M 2 ：A r a b i d o p s i st h a l i a n aC a l m o d u l i ni
16、s o f o r m2 C a M B D ：C a l m o d u l i nB i n d i n gd o m a i n C a M B P s ：C a l m o d u l i nB i n d i n gP r o t e i n s C F P ：c y a nf l u o r e s c e n tp r o t e i n C N G C ：C y c l i cN u c l e o t i d e - G a t e di o nC h a n n e l E C F P ：E n h a n c ec y a nf l u o r e s c e n tp r o t e i n E G T A ：E t h y l e n eG l y c o l - b i s ( 1 3 - a i m o e t h y l e t h e r ) - N ，N ，N ，N - T e t r a c e t i cA c i d E Y F P ：E n h a n c eY e l
