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1、上海交通大学 硕士学位论文 FGF9突变转基因及基因敲入小鼠模型的建立与分析 姓名：陈晓怡 申请学位级别：硕士 专业：医学遗传学 指导教师：顾鸣敏 20090501 上海交通大学医学院硕士研究生学位论文 11 缩缩 略略 词词 SYNS multiple synostoses syndrome SYM1 symphalangism BMP bone morphogenetic protein GDF5 growth/differentiation factor-5 FGF9 fibroblast growth factor9 FGFR3 fibroblast growth factor rec
2、eptor3 COL2A1 collagen type II COL10A1 collagen type X OD obsorbtion degree BSA bovin serum albumin G418 neomycin wt wild type Mut mutant BAC bacterial artificial chromosome Neo neomycin resistant gene PGK phosphoglycerate kinase ES embryonic stem 上海交通大学医学院硕士研究生学位论文 1 上海交通大学上海交通大学 学位论文原创性声明学位论文原创性声明
3、 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 上海交通大学医学院硕士研究生学位论文 2 上海交通大学上海交通大学 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权上海交通
4、大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存和汇编本学位论文。 保密保密，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密不保密。 （请在以上方框内打“”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 上海交通大学医学院硕士研究生学位论文 3 FGF9 突变转基因和基因敲入小鼠模型的建立与分析 摘 要 第一部分 FGF9 突变转基因及基因敲入小鼠模型的建立与分析 在常染色体显性遗传病中，多发性骨性连接综合征(multiple synostosis syndrome, SYNS)是一类少见的骨关节发育不全
5、综合征，表现 为多处关节强直或融合。儿童期即可发病，并呈进行性发展，最后发展 为关节骨性融合。多发性骨性连接综合征存在遗传异质性。迄今已报道 的多发性骨性连接综合征有二种类型，分别为由 17 号染色体的 Noggin 基因突变引起的 SYNS1(MIM 186500)型和 20 号染色体的生长分化因子 -5 (growth/differentiation factor-5, GDF5)基因突变引起的 SYNS2 (MIM 610017)型。 研究的前期工作对来自青海省一个由五代共56人组成的SYNS大家 系进行了候选基因连锁分析和测序分析，排除了由 NOG 基因和 GDF5 基因致病的可能性，
6、提出 SYNS 存在第三种遗传异质性，命名为 SYNS3 型。并最终确定这一家系的 SYNS 是由成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor 9, FGF9)基因突变所致。 上海交通大学医学院硕士研究生学位论文 4 FGF9是成纤维细胞生长因子（FGF）家族的成员之一，由208个氨基 酸组成，其中在96101位为一个非常保守的EFISIA基序。成纤维细胞生 长因子受体（Fibroblast growth factor receptor, FGFR）属于酪氨酸蛋白激 酶家族，它们与成纤维细胞生长因子结合，在骨发育及损伤修复过程中 发挥重要作用。目前所知，FGF9及FGF
7、R3的突变能引起软骨发育不全、 软骨发育不足等一系列人类骨骼发育缺陷疾病。 本研究针对 fgf9 和主要的结合受体 fgfr3 在成年小鼠体内的表达进 行了一系列实验，发现 fgf9 在出生后的小鼠体内主要表达于心脏、脑组 织、肾、骨骼肌和骨关节中，fgfr3 的组织表达较 fgf9 更为广泛一些。同 时从实验中可以看出， fgf9 和 fgfr3 的表达情况在小鼠出生后不同年龄都 不相同，但二者之间的表达较为一致。这些结果为我们研究 FGF9 突变 导致多发性骨性连接综合征发病机制奠定了一定的理论基础，对我们的 研究工作有重要的意义。 同时，此前的体外实验提示突变 FGF9 可能通过影响软骨
8、细胞的增 殖及终末分化，进而影响了软骨内骨化的过程。为进一步研究 FGF9 在 SYNS3 型发生中的作用，建立了在软骨组织中特异性表达正常及突变 FGF9 cDNA 的转基因小鼠。本研究利用 RT-PCR 和免疫组化及 X 光照 射的手段，对已建立的转基因小鼠进行了表型分析，发现转基因首建小 鼠能将外源基因稳定地传递到下一代。但在转基因小鼠个体的研究中发 现外源基因 FGF9 在 RNA 和蛋白质水平都没得到表达， 也未出现异常表 上海交通大学医学院硕士研究生学位论文 5 型。推测其原因可能是转基因过程存在随机性，会产生外源基因导入后 被沉默的现象。此外，由于转入的外源基因为人的 FGF9
9、基因，而在小 鼠体内本身也存在内源性的 fgf9 基因，导致转入的 FGF9 基因受到竞争 抑制而没有表达。为此，课题组正在建立 fgf9S99N单碱基突变敲入小鼠模 型，以期更精确地模拟自发突变，研究突变 FGF9 对关节发育、软骨增 殖与分化的作用，进而解释由于单个碱基置换所导致的 FGF9 基因的生 物学功能变化以及导致 SYNS3 型出现多发性骨性融合的可能机制， 并为 该病的基因诊断和基因治疗奠定坚实的基础。 关键词：多发性骨性连接综合征，成纤维细胞生长因子 9，转基因小鼠， 基因突变敲入小鼠，表达谱 第二部分 1700016G05Rik 基因敲除小鼠模型的建立及表达谱分析 RIKE
10、N cDNA 1700016G05（1700016G05Rik） 基因在小鼠基因组中位 于 6 号染色体，共有 6 个外显子组成。1700016G05Rik 基因翻译产物蛋 白共 237 个氨基酸，为分泌性肽，预测该蛋白属于酪氨酸样丝氨酸蛋白 激酶家族。 NCBI 上显示该基因在小鼠中特异的高表达于成年小鼠的睾丸 上海交通大学医学院硕士研究生学位论文 6 中。因此可预测，1700016G05Rik 基因可能在小鼠的睾丸中发挥作用， 对小鼠的精子生成等过程产生影响。 至今在国际上尚未有对于 1700016G05Rik 基因研究的文献报道，因 此，我们拟建立基因敲除的小鼠模型，观察 1700016
11、G05Rik 基因的缺失 对小鼠的表型是否产生影响， 并可通过这些研究推测其在人体中的功能。 目前，已得到嵌合体小鼠，现正与野生型小鼠交配中。同时，在 RNA 水 平对 1700016G05Rik 基因在小鼠体内的表达情况做了分析，证实该基因 确实在成年小鼠睾丸内特异性高表达，推测该基因可能在睾丸中发挥作 用。这一发现对研究 1700016G05Rik 基因的功能有重要的意义。 关键词：1700016G05Rik 基因，基因敲除小鼠，表达谱 上海交通大学医学院硕士研究生学位论文 7 CONSTRUCTION AND ANALYSIS OF FGF9 MUTATION TRANSGENIC/KN
12、OCK-IN MICE ABSTRACT Part I CONSTRUCTION AND ANALYSIS OF FGF9 (S99N) POINT MUTATION TRANSGENIC MICE AND KNOCK-IN MICE Multiple synostosis syndrome (SYNS) is a kind of autosomal dominant disorders characterized by multiple areas of progressive joint space narrowing and joint fusions. Joint ankylosis
13、begins in early childhood and is progressive. There are two forms: one form of multiple synostoses syndroem (SYNS1，MIM 186500) is due to mutations in the gene encoding noggin (NOG; MIM 602991) on chromosome 17q. Another form of the disorder (SYNS2，MIM 610017) is caused by mutation in the gene encodi
14、ng growth/differentiation factor-5 (GDF5; MIM 601146) on chromosome 20. Mutation detection for NOG and GDF5 genes has already done to a 上海交通大学医学院硕士研究生学位论文 8 five-generation family of SYNS from Qinghai Province, China. And the results were both negative. We named the novel genetic heterogeneity of SY
15、NS as SYNS3. Mutation analysis revealed a novel S99N mutation in the FGF9 gene in all affected family members. The fibroblast growth factor (FGF) family consists of 23 members. FGF9 is one of the fibroblast growth factor families, consisting with 208 amino acids. There is a conserved EFISIA motif in the core area between 60-109 amino acids. FGF superfamily members signal via transmembrane tyrosine kinase receptors of which there are 5 types, designated FGFR1-5. FGF9 is mainly binding with FGFR3 which is expressed
