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1、华中科技大学 博士学位论文 基于毛细管电泳的量子点生物探针分离检测新技术研究 姓名：李永强 申请学位级别：博士 专业：生物医学工程 指导教师：赵元弟 2011-05-18 I 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 摘摘 要要 随着生命科学的发展，待测生物样品的复杂性越来越高，从而对分析方法的检 测灵敏度、效率、速度、通量及成本提出了更高要求。作为一种新型的荧光探针， 量子点具有有机荧光染料和荧光蛋白无法比拟的光学性质，近年来基于量子点的荧 光分析法已在生物分析领域得到了广泛应用。另一方面，作为一种高分辨、高灵敏、 高速度、高通量及低样品消耗的微分离技术，毛细管
2、电泳在生物分析领域也具有广 阔的应用前景。基于此，本论文将上述两种分析方法进行了结合，建立了一种基于 量子点探针和毛细管电泳的分析新方法（即利用量子点作为荧光探针，毛细管电泳 荧光检测作为分析手段， ） ，并重点研究了其在生物分析检测中应用。论文完成的工 作如下： （1）采用毛细管筛分电泳对不同粒径的水溶性 CdSe/ZnS 核壳量子点进行了分 离，并探讨了筛分介质的种类和浓度、缓冲溶液的浓度和 pH、分离电压对量子点分 离的影响。在这些因素优化条件下，四种不同粒径的量子点得到了有效分离，且重 现性良好， 迁移时间的最大相对标准偏差为 1.01%， 且量子点的电泳淌度和粒径间存 在着很好的相关
3、性（R2=0.997） 。实验证实，这一方法可用于水溶性 CdSe/ZnS 核壳 量子点的粒径测量。这一工作为量子点粒径的检测提供了一种新的方法，同时也为 接下来基于毛细管电泳技术和量子点荧光探针的生物分析提供了重要参考。 （2）分别选用发射波长为 532 nm 的 CdTe 量子点和 632 nm 的 CdSe/ZnS 量子 点作为荧光共振能量转移体系的供体和受体，通过共价偶联的方法将上述两种量子 点分别标记上小鼠 lgG 和羊抗小鼠 lgG， 抗原和抗体间的免疫亲和作用拉近了两种量 子点间的距离，从而导致供体和受体间荧光共振能量转移的发生。我们利用毛细管 电泳对上述荧光共振能量转移进行了分
4、析。实验中，为了同时检测两种量子点的荧 光强度变化，我们利用两个固定检测波长通道分别对供体和受体的荧光强度进行了 同时检测。在成功地通过毛细管电泳实现荧光共振能量转移体系与其它“多余”的荧 光物得到有效分离的同时，准确测量了供体及受体的荧光强度，并计算了不同浓度 II 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 受体情况下的荧光共振能量转移效率（38.56-69.58%） ，这一效率比常规的荧光强度 测量法得到的荧光共振能量转移效率（12.77-52.37%）有一定程度的提高，而且对荧 光共振能量转移的观察更加直观，灵敏度更高，样品消耗更少。这一工作为荧光共 振能量
5、转移的研究提供了一种新的分析方法。 （3） 分别利用亲和素-生物素系统及直接共价偶联的方法将荧光发射波长为 585 和 650 nm 的 CdTe 量子点与两种具有不同碱基序列的分子信标进行了连接，构建得 到了两种量子点-分子信标探针。 量子点-分子信标探针与不同靶标杂交后的毛细管电 泳结果表明，这两种量子点-分子信标探针都只与和其环状部分序列完全互补的靶标 特异性杂交， 且都具有对单碱基突变识别的能力。 利用这两种量子点-分子信标探针， 我们借助毛细管电泳成功地实现了对特定核酸序列两个位点单碱基突变的同时检 测。这一研究不仅为今后多位点的核酸单碱基突变检测提供了重要手段，而且在诸 如核酸高灵
6、敏度检测及单核苷酸多态性研究领域中也有很广泛的应用前景。 （4）分别将 CdSe/ZnS 量子点及金纳米颗粒与不同碱基长度的互补 DNA 单链 进行了偶联，并通过 DNA 链的互补杂交将量子点与金纳米颗粒连接到一起，构建得 到了一个研究溶液中金属增强量子点荧光的模型，然后利用毛细管电泳考察了金纳 米颗粒和量子点间的距离对量子点荧光增强的影响。实验结果表明溶液中的金纳米 颗粒增强量子点荧光有很强的距离依赖性， 只有与金纳米颗粒与量子点相距 6.8-18.7 nm 时，量子点才出现荧光增强效应，其中 11.9 nm 是金纳米颗粒增强量子点荧光的 最佳距离，此时量子点的荧光强度增强为原来的 2.3
7、倍。接下来，我们在量子点和纳 米金颗粒相距 11.9 nm 的体系中加入与量子点偶联的 DNA 链相同碱基序列的目的 DNA，利用目的 DNA 与量子点-DNA 间的特异性竞争，实现了对 19.6 pg (15 nM)目 的 DNA 的检测。 这一工作不仅为今后溶液中金属增强量子点荧光的研究提供了重要 参考，而且在诸如 DNA 杂交分析及高灵敏度 DNA 检测等领域也有很广泛的应用前 景。 关键词：关键词：量子点 毛细管电泳 粒径测量 荧光共振能量转移 单碱基突变 金属增强荧光 III 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 Abstract With the
8、development of life science, the complexity of biological sample is increasing, which makes higher request for the detection speed, efficiency, throughout, sensitivity and cost of analytical method. As a new type of fluorescent probes, quantum dots (QDs) have many unique excellent optical characteri
9、stics compared with traditional organic dyes and fluorescent proteins, and QD-based fluorescent sensors have been widely used in biological analysis in recent years. Capillary electrophoresis (CE) is one of the most powerful micro-separation techniques with advantages of fast, high sparation resolut
10、ion, high sensitive, low sample consumption and high throughout, and also has been applied in bioanalysis. Therefore, the combination of QDs probes with CE detection techniques would have broad application prospects in bioanalysis. This thesis mainly focuses on the establishment of a new analytical
11、method based on the combination of QDs probes with CE techniques, and its application in biological analysis and detection. The main contents and results are summarized as follows: (1) A highly efficient method for size determination of water-soluble CdSe/ZnS core-shell QDs was set by CE using polym
12、er additive as sieving medium. The influence of some factors, such as kinds and concentrations of the sieving medium, pH and concentrations of the background electrolyte, and applied voltage, on the separation of QDs were investigated. Under the optimal separation conditions, four different sized QD
13、s were successfully separated, and the relative standard deviation of the migration times for these QDs were 1.01%. In addition, an equation was fit by taking into account the correlation existing between the electrophoretic mobilities and the sizes of a set of QDs. The feasibility of this equation
14、to measure the sizes of other QDs was confirmed by comparison with the sizes obtained by transmission electron microscopy experiment. This work offers a novel method for size determination of QDs, and provides an important reference on our subsequent bioanalysis based on CE and QDs probe. IV 华华 中中 科
15、科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 (2) A fluorescence resonance energy transfer (FRET) system was designed, which consisted of water-soluble 532 nm-emitting CdTe QDs donor and 632 nm-emitting CdSe/ZnS QDs acceptor. The QDs donor and acceptor were covalently conjugated with mouse lgG and goat anti-mouse lg
16、G, respectively. The bio-affinity between antigen and antibody brought two kinds of QDs close enough to make the FRET happen between them. Then CE with fluorescence detection was used for the analysis of above QD-based FRET system. In the CE experiments, the real-time fluorescence signal of donor and acceptor were simultaneously collected by two signal channel with fixed detecting wavelength, and an effective separation of d
