盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶（mnsod）的基因克隆、表达与功能研究

《盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶（mnsod）的基因克隆、表达与功能研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶（mnsod）的基因克隆、表达与功能研究（86页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、题 目 四川大学 硕士学位论文 作者翌竖竖完成日期2 Q Q Z 生! 旦2 Q 旦 培养单位生全盘堂堂瞳 指导教师萱塑i 邋 专 业 丝生堑堂 研究：h - - 向塑生堑坌i 垒堑鲎 授予学位日期生旦旦 四川大学硕士学位论文 盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶( M n S O D ) 的基因克隆、 表达与功能研究 研究生邓婷婷 微生物学专业 指导教师曹毅 超氧化物歧化酶( S O D ) 是一种能催化超氧自由基( 0 2 ) 发生歧化反应的 金属酶。由于超氧自由基( 0 2 - ) 被认为对各种生物大分子及其它细胞组分具有严 重的损伤作用，因此S O D 被认为是体内对抗自由基的第一道防线，其分子

2、生物学 基础及应用研究备受关注。按照结合金属离子种类不同，目前己知的S O D 主要 有以下三种，l l P F e - S O D ，M n S O D 和C u Z n - S O D 。其中，M n - S O D 多为诱导表达 型，氧自由基对h 佃S O D 的表达有显著的诱导作用。因此，M n s 0 D 在机体适 应环境变化，尤其在应对环境胁迫方面可能发挥重要作用。 盐生杜氏藻( D u n a l i e l l as a l i n a ) 是高耐盐性的单细胞真核绿藻，能在含饱和的 N a C I 培养液中生存，而且能够在紫外辐射极强的青藏高原生存，具有较高的耐 紫外线特性。通

3、过比较几种蓝、绿藻粗酶液中的S O D ，发现盐藻M m - S O D 的比 活性高达1 0 5 3 U m 舀是螺旋藻的十几倍，这在一般的藻类中是不多见的。本 实验对盐藻体内M m S O D 活性与外界胁迫的关系做了研究，发现在不同的盐胁 迫、紫外胁迫和温度胁迫下，盐藻体内M n S O D 活性与胁迫强度呈正相关。因 此我们推测：杜氏盐藻抗逆机制与I V m S O D 存在着联系，盐藻在耐盐碱以及耐 辐射能力上与其他物种巨大的差异很可能与盐藻M m S O D 的自身特性相关，比 如含量的多少，酶活性质等，除此之外，也可能与基因在在受诱导后的表达量 有关。因此，研究盐生杜氏藻M n

4、S O D 基因及其蛋白功能够帮助揭示盐藻独特 的耐盐等机理。 为了解决上述问题，本文开展了以下内容的研究： 四川大学硕士学位论文 一、盐生杜氏藻M n S O D 与盐、碱及紫外胁迫联系的生理实验。针对盐藻耐 盐、碱和抗紫外的特点，通过在盐、碱和紫外胁迫环境下测定盐藻粗酶中M n S O D 的酶活，得出盐藻M n S O D 活性与盐、碱和紫外胁迫条件呈正相关的结果，初 步证实盐藻M n S O D 具有与抗逆相关的特性，为立题提供了有效的实验依据。 二、克隆盐生杜氏藻M n S O D 基因的e D N A 全长。通过同源克隆的方法，首 先成功的克隆到盐生杜氏藻M n S O D 基因的

5、一段E S T 序列，接着通过5 R A C E 和3 R A C E 技术，获得了其全长e D N A 序列，命名为D s M n S O D 。 三、对杜氏盐藻M n S O D 基因及其推演出的蛋白质序列进行相关的生物信 息学分析，发现盐藻M n S O D 蛋白与大多数M n S O D 蛋白在结构和性质上的相 同之处，进一步证实了M n S O D 是一类比较保守的蛋白。 四、通过功能互补研究，证实了M n S O D 蛋白在杜氏盐藻耐盐、抗紫外、抗 寒和抗氧胁迫方面具有贡献。通过构建表达载体p E T 3 2 a - M n s o d ，转入大肠杆菌 S O D 突变株K 1 2

6、 ，检测蛋白在不同胁迫条件下对菌株的保护作用。结果显示， 盐藻M n S O D 具有抗逆功能，特别是其耐盐和抗紫外功能突出，与杜氏盐藻自 身的抗逆特点相同，更加说明M n S O D 在盐藻抗逆机制中发挥着重要作用。 五、建立起D s M n S O D 基因的原核表达体系，得到纯化的融合蛋白，测定并 分析其生理生化属性，发现蛋白具有金属酶特性，受M 1 1 2 + 调控表达，具有广泛 的p H 耐受范围( p H 4 1 1 ) 和较好的温度耐受能力( 在8 5 水浴中酶活能维持 2 小时) ，为今后开展下游相关工作奠定了基础。 本文在研究盐生杜氏藻( D u n a l i e l l

7、as a l i n a ) 的M n S O D 在逆境中的生理特性 基础上，克隆得到了杜氏藻M n S O D 基因，并通过功能互补实验鉴定其功能，通 过原核表达和纯化研究其蛋白性质。研究基础且较为完善，对今后的应用工作 打下了坚实的基础。 关键词：盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶超氧自由基抗逆克隆 原核表达功能互补 四川大学硕士学位论文 C l o n i n g ，e x p r e s s i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f t h eg e n e c o d i n gf o rt h em a n g a n e s es u p

8、 e r o x i d ed i s m u t a s ei n g r e e na l g aD u n a l i e l l as a l i n a M A J O RM i c r o b i o l o g y G R A D U A T E DS T U D E N T D e n gT i n g t i n g T U T O RC a oY i T h ef i r s te n z y m e si n v o l v c di nt h ed e t o x i f i c a t i o no f o x y g e nf r e er a d i c a l

9、sa l et h e S O D s ，w h i c hc o n v e r ts u p e r o x i d ea n i o ni n t oH 2 0 2a n d0 2 A st h eo x y g e nf r e er a d i c a l s b e i n gb a df o rc e l l s ，t h es u p e r o x i d ed i s m u t a s e s ( S O D s ) c o n s t i t u t et h ef i r s tl i n eo f d e f e n c ea g a i n s tR O S A

10、n dt h er e s e a r c ho ft h eb a i s ck n o w l e d g ea b o u tm o l e c u l a r b i o l o g ya n dt h ea p p l i c a t i o ni sp u ti nav e r yi m p o r t a n tp o s i t i o n S of a r ，b a s e d0 1 1t h e m e t a lC O - f a c t o ru s e db yt h ee r l z y m e ，S O D sa r ec l a s s i f i e di n

11、 t ot h r e eg r o u p s ：i r o nS O D ( F eS O D ) ，m a n g a n e s eS O D ( M nS O D ) ，a n dc o p p e r - z i n cS O D ( C u - Z nS O D ) D u n a l i e l l as a l i n ai sa nu n i c e l l u l a rg r e e na l g aw h i c hi su n i q u ei ni t sa b i l i t yt o a d a p tt oh y p e r s a l i n ee n v

12、 i r o n m e n ta n dh a sh i g he c o n o m i ci m p o r t a n c e I tc a ns u r v i v e i nam e d i u mw i mO 0 5 - 5 5m o F LN a C Ia n dl i v ei nQ i n g h a i T i b e tP l a t e a uw h e r e a b o u n dw i t he x t r e m eU V l i g h t T h eM n S O Di nD u n a l i e l l as a l i n ah a sa l m o

13、 s t1 0 i s o z y m e s ，i t sa c t i v i t yi su pt o1 0 5 3 U m gw h i c hi sm o r et h a nt e nt i m e sc o m p a r et o S p i r u l i n a S T h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nS O Da c t i v i t ya n de n v i r o n m e n ts t r e s s i n D u n a l i e l l as a l i n ah a sb e e ns t u d i e

14、 di nt h i sr e s e a r c h I nd i f f e r e n ts t r e s s ( s u c ha ss a l t , U Vl i g h ta n dt e m p e r a t u r e ) t h eS O Da c t i v i t ys h o w sp o s i t i v er e l a t i v i t yw i t hs t r e s s i n t e n s i t y S oi ti sh y p o t h e s i z e dt h a tS O Dm i g h tt a k ep a r ti ns

15、t r e s Sr e s i s t a n c e T h e c h a r a c t e r i s t i ca n dt h en u m b e ro ft h ee n z y m em a yc 目t u s ed i f f e r e n ta b i l i t yt oa g a i n s t e x t r e m ee n v i r o n m e n t S os t u d yO i lS O Di ng e n ea n dp r o t e i nl e v e l sw i l lh e l pt o 1 1 1 四川I 大学硕士学位论文 u n

16、 d e r s t a n dt h em e c h a n i s mo f D u n a l i e l l as a l i n ai ns 仃c s sr e s i s t a n c e I nt h i ss t u d yw e g o tt h e s er e s u l t s ： 1 C h a r a c t e r i z i n gt h eD 订西娼D Du n d e rs t r s sc o n d i t i o 璐S i n c eD u n a l i e l l as a l i n a h a v et h ea b i l i t yo f s a l t - a l k l i - a n dU V - t o l e r a n c e , w em e s u r e dt h ea c t i v i t yo f M n S O D u n d e rs t r e s sc o n d i t i o n si nt h ec e