《大花蕙兰抗病转基因体系及相关技术研究(1)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大花蕙兰抗病转基因体系及相关技术研究(1)（127页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、南京林业大学 博士学位论文 大花蕙兰抗病转基因体系及相关技术研究 姓名：吴开云 申请学位级别：博士 专业：林木遗传育种 指导教师：王明庥;黄敏仁 20080601 摘要 以培育广谱抗病大花蕙兰为目标，将外源双价抗病基因G A F P 和N P 1 以农 杆菌介导法导入大花葱兰基因组。对包括大花蕙兰诱导类原球茎( V L B ) 再生、农 杆菌介导大花蕙兰抗病基因转化、大花蕙兰转基因植株分子检测、大花蕙兰转基 因植株抗病性检测等几个相关方面进行了比较系统的研究。 一、分别以大花蕙兰试管苗叶片和基部切块作为外植体，成功诱导出P L B ， 实现大花蕙兰组培再生技术。基于M S 培养基，大花蕙兰幼苗
2、叶片诱导P L B 是 可以实现的，但叶片部位对P L B 诱导有最重要的影响，叶片基部可以诱导P L B ， 而中段和叶尖基本不会诱导出P L B 。利用大花蕙兰试管苗基部切块获得更高的 P L B 诱导率和繁殖系数。 二、实验结果表明，未经转化的大花蕙兰P L B 对卡那霉素( K m ) 的敏感性很 高。当K i n 浓度达到7 5m g L 时，C A H 和P E T 的P L B 继代诱导率为0 。当 K m 浓度达到1 2 5m g L 时，C M M 和C 的P L B 继代诱导率为0 。筛选培养 基的K m 最佳浓度( 选择压) 为1 2 5 m g L 。不同抗生素对农杆菌
3、的抑制效果有显著 差异，在5 个种类的抗生素中，以头孢霉素( C e f ) 抑菌效果最佳，并且对大花蕙兰 P L B 的继代增殖诱导影响不明显，筛选培养基最佳C e f 浓度设为5 0 m g L 。 三、本研究独创性地采取参数池研究策略，利用携带p B i n 3 5 S G A F P - N P l 基因质粒的L B A 4 4 0 4 工程菌株，分两步正交实验完成了对农杆菌介导基因转化 的影响因子的研究。通过第一步实验，确定在预培养基添加A S 显著提高基因转 化的效率，最佳A S 浓度为1 0 0 m o l L ，当O D 6 0 0 值在0 2 A b s 时大花蕙兰转化 阳性
4、率最高。侵染液和共培养基p H 值为5 2 时，转化子f E l , 生率最高。第二步实 验确定最佳侵染时间为2 0 m i n ，最佳的预培养时间为4 d ，较长的共培养时间如 6 d 和9 d 的转化率显著提高。独创的“二次筛选转化子继代诱导P L B 抗K m 一致 性筛选策略”，在筛选抗K m 阳性转化子的实验中得到成功运用。 四、本研究用改进的S D S 裂解法的提取大花蕙兰D N A 样品，限制性内切酶 酶切效果和引物P C R 扩增效果均比较理想。用S D S 和异硫氰酸胍两种不同的蛋 白变性剂，分别进行了R N A 提取实验，其中S D S 法提取的R N A 的产量较高。 本
5、研究显示抗K i n 阳性的转化子均可以通过特异引物P C R 反应检测到目的基因 条带。S o u t h e r nb l o t 结果表明目的基因已整合到大花蕙兰基因组D N A 中，而且 既有单拷贝也有多2 个以上拷贝的转化子。R T - P C R 实验结果在基因表达水平上 进一步确定外源基因已整合到大花蕙兰基因组中，并能在大花蕙兰组织中表达。 五、从大花蕙兰炭疽病病叶分离得到病原茵，经接种实验表明具有使大花蕙 兰发生炭疽病的能力，鉴定为胶孢炭疽病菌( C o l l e t o t r i c h u mg l o e o s p o r i o i d e s S a c c )
6、 。通过叶片蛋白提取液的琼脂糖孔穴扩散抑菌实验和炭疽病接种离体叶片 的抗病试验，证明获得的转基因大花蕙兰具有对炭疽病的抗性。 A BS T R A C T 1 1 l em a j o ro b j e c t i v eo ft h i ss t u d yw a st ob r e e dn e wC y m b i d i u mh y b r i d u m v a r i e t i e sw i t hi m p r o v e dr e s i s t a n tp e r f o r m a n c ea g a i n s tv a r i o u sp a t h o g
7、e n st h r o u g h t r R n s f o r m a t i o no ft h eG A F P + N P 1b i v a l e n tg e n e sb yu s i n gA g r o b a c t e r i u m m e d i a t e t r a n s f o r m a t i o nt e c h n o l o g y F o rt h i sp u r p o s e ，Ah i g hf r e q u e n c yr e g e n e r a t i o ns y s t e mo f C y m b i d i u mh
8、 y b r i d u mw a se s t a b l i s h e ds u c c e s s f u l l y ，a n df a c t o r st h a ta f f e c t i n gt h e f r e q u e n c yo fA g r o b a c t e r i u m m e d i a t et r a n s f o r m a t i o nf o rC y m b i d i u mh y b r i d u mw a s t e s t e d ，a n dt h et r a n s g e n i cp l a n t sw e r
9、 eo b t a i n e da n da u t h e n t i c a t e db yas e r i e so f r e l e v a n tm o l e c u l a rb i o l o g ya n a l y s i sa n dd i s e a s e r e s i s t a n c ei d e n t i f i c a t i o n 1 、P L B ( P r o t o c o r m 1 i k eb o d y lr e g e n e r a t i o ns y s t e mo fC y m b i d i u mh y b r i
10、 d u mw a s e s t a b l i s h e ds u c c e s s f u U v w h i c hu s e db o t hs e g m e n t so fl e a fa n dp i e c e so fc u t e dp l a n t l e t b a s e 嬲e x p l a n t s U s i n gt h eM Sm e d i u ma st h eb a s i cm e d i u m P L Bi ss u c c e s s f u l l y i n d u c e df r o mt h el e a r - s e
11、g m e n t so fv i t r o s e e d l i n g so fC y m b i d i u mh y b r i d u m P L BC a n b ei n d u c e do n l yf r o mt h eb a s eo fl e a fi nt e s t s 2 、R e s u l t ss h o w e dt h a t ：u n t r a n s f o r m e dP L B sw e r ei n h i b i t e dv e r ys e n s i t i v e l yb y K m 、胁e nt h ec o n c e
12、 n t r a t i o no fK mw a s7 5m g L c o n t i n u a t i v ei n d u c e m e n to fP L B f r o mc u t e dP L Bo fC A Ha n dP E Tg e n o t y p ew a sf u l l yi n h i b i t e d a n dc o n t i n u a t i v e i n d u c e m e n to fP L Bo nC 删a n dC W Ig e n o t y p ew a sf u l l yr e s t r a i n e da tK ml
13、 e v a lo f 1 2 5 m g L ：C e fh a st h em o s to u t s t a n d i n gr e s t r a i ne f n c i e n c yo nt h ee n g i n e e r i n g b a c t e r i a w h i l et h ed i s a d v a n t a g e o u si n f l u e n c eo fC e fo nP L Bi sn o te v i d e n c e 3 、I nt h i ss t u d yo fg e n e t i c a lt r a n s f
14、o r m a t i o nf o rCh y b r i d u m w i t hA g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n ss t r a i nL B A 4 4 0 4c a r r y i n g b i n a r y v e c t o r p B i n 3 5 S G A F P 小1 a p a r a m e t e r - p o o ls t r a t e g Yw a si n t r o d u c e dt os t u d yo nf a c t o r si n f l u e n c i n ge f
15、 f i c i e n c yo f t h et r a n s f o r i l l a t i o ni nt w or e s e a r c hs t e p s T h ed a t af r o mf i r s t h a n dt e s t ss h o wt h a t ：T h e e f n c i e n c yo fg e n e t i c a l 仃a n s f o r i l l a t i o nw a sa d v a n c e dr e m a r k a b l yw h e nA SW a su s e di n p r e c u l t
16、 u r i n gm e d i a a n do p t i m u mv a l u eo fA Sc o n c e n t r a t i o nw a s10 0 1 x m o l L ；，l l e n a g r o b a c t e r i u mi n o c u l u ml i q u o rw a sa t0 2d e n s i t yo fO D 6 0 0 ，w h i l ep Hv a l u eo ft h e i n o c u l u ml i q u o ra n dC O - c u l t u r i n gm e d i aw a ss e t e da t5 2 t h eK m r e s i s t a n c ep o s i t i v e r a t e sw a sh i g h e s t A to p t i m u ml e v e lo fA Sa n dp Ha n di n o c
