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1、潮汕沿海地区食管癌高发的分子基础特点以及 从海洋生物资源中开发抗食管癌药物的研究设想 李恩民1张尔贤2 ( 1 汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室，广东汕头5 1 5 0 3 1 2 汕头大学理学院生物系，广东汕头5 1 5 0 6 3 ) 一、潮汕沿海地区食管癌高发 潮汕沿海地区是我国六大食管癌高发区之一，而且是唯一的沿海食管癌高发区。这一事实的科学认 证源于1 9 7 3 至1 9 7 6 年由国家肿瘤防治办公室组织发起的全国范围的恶性肿瘤死亡流行病学大调查。 根据此次调查结果，潮汕地区的南澳县( 一个岛屿县) 食管癌的死亡率高达1 0 0 8 7 1 0 万。被确定为潮 汕沿海食管
2、癌高发区的核心。在随后的2 8 年中，虽然未再进行过象1 9 7 3 至1 9 7 6 年那样规模的食管癌死 亡流行病学调查，但一些针对潮汕部分地区幢或来自于当地肿瘤专科医院瞄1 的流行病学调查资料显示， 汕头沿海地区食管癌一直持续高发。在当地，食管癌的发病率一直位居各种肿瘤之首。食管癌是潮汕沿 海地区的一种特色疾病资源。 二潮汕沿海地区食管癌的发病因素 多数研究者认为，食管癌是环境中致癌物引起的疾患。但是，目前所提出的各发病因素中，尚没有 一个被普遍接受的因素能够解释各个高发区的现象。从现有资料来看，食管癌可能是多种因素所致的疾 病。不同的地区，食管癌发病因素可能不同。甚至同一地区，不同患者
3、的发病因素也可能不同。在潮汕 沿海地区，酸菜、鱼露、虾酱、咸菜和萝卜千等食物以及饮水中的亚硝基化合物1 ，不良的饮食习惯如 饮烫茶、吃烫食、吃硬饭和吃饭快等所导致的食管损伤踌1 ，人乳头瘤病毒( H P V ) 感染哺1 ，遗传易感基因 ，大量饮劣质白酒，大量吸烟，V A 、V B 2 和V C 等维生素的摄入不足，锌和硒等微量元素的缺乏或铜 等微量元素的过量撺1 以及海水污染等因素的作用均曾被怀疑可能与该地区食管癌的高发有关。 三食管癌发病的分子基础 近1 0 年来，随着分子生物学理论和技术的不断发展，在基因水平上开展食管癌病因及其发病机理研 究已成为人们关注的热点。这其中有关癌基因和抑癌基
4、因的改变与食管癌的癌前病变、病理类型、病情 发展以及预后的关系被研究得较多。人们期望通过阐明食管癌发病的分子基础，能够在基因水平上找到 一种可以体现食管癌早期病变的特异性标志，以适应早期发现、早期诊断和早期治疗以及监测病情发展、 判断预后和病理转归的需要。研究结果表明，目前所研究的各种癌基因和抑癌基因，如m y c 、r a s 、E G F R 、 i n t - 2 、C y c l i nD 1 、p 5 3 、R b 、p 1 6 、M C C 、A P C 等与食管癌的发生发展确有一定的关系，但并非高度相关， 而且特异性也不强旧1 。在这种情况之下，克隆鉴定新的组织特异性强的食管癌癌
5、变高度相关基因，对于 在基因水平上揭示食管癌病因及发病机理以及在此基础上提高食管癌的预防和诊治水平都将具有非常重 要的意义。 近几年来，H P V 感染与食管癌发病的关系问题倍受人们关注。分子流行病学调查结果显示，在我国 山西n0 、四川1 和陕西铂等省的高发区，食管癌人群H P V 感染率达5 0 以上，而潮汕沿海高发区这种情 况更加严重，有高达8 0 以上的食管癌患者H P V 感染呈阳性n 射。1 9 9 8 年我们课题组的沈忠英等人，通过 2 5 5 H P V l 8 型E 6 E 7 基因转化正常人胚食管上皮细胞，建立了一株永生化食管上皮细胞系S H E E u 制；而在此基 础上
6、，通过促癌物十二烷基葵豆寇( T P A ) 的作用使S H E E 发生恶性转化，又建立了一株食管癌细胞系 S H E E C n 副。很显然，上述细胞系的成功建立不但是对验证 I P V 感染可能是食管癌的致病因素之一的一次 有力地证据支持，同时也为在基因水平上研究食管上皮细胞恶性转化机制提供了一对很好的细胞模型。 在此基础上，我们应用c D N A m i c r o a r r a y 、R T - P C R 和R N Ab l o t i n g 等技术研究发现在T P A 诱导永生化食管 上皮细胞的恶性转化过程中存在着N G A L ( n e u t r o p h i lg
7、e l a t i n a s e a s s o c i a t e dl i p o c a l i n ) 基因的显著 异常过表达n 引。氨基酸同源性分析表明，来源于S H E E C 中的N G A L 与来源于人类其它细胞，如中性粒细 胞以及卵巢癌细胞中的N G A L 序列几乎完全一致( 9 9 ) ，而与小鼠的2 4 p 3 和大鼠的N R L 的同源性也较高 ( 7 0 以上) 。小鼠2 4 p 3 是癌基因作用的产物，当猴病毒4 0 ( S V 4 0 ) 、多瘤病毒或其它肿瘤病毒感染小鼠 肾细胞时可刺激2 4 p 3m R N A 的表达增加7 - 1 0 倍，且随着大T
8、抗原的合成增加而升高n 钉。而一些促癌 物质如佛波醇酯( T P A ) 等也可诱导2 4 p 3 表达增高，这提示2 4 p 3 可能是一种新的癌基因或促癌基因。N R L 是H E R n e u 癌基因诱导的大鼠乳腺癌唯一过表达的基因，比正常升高1 2 倍，可能在n e u 基因信号通路的 下游发挥作用，与乳腺癌快速生长和浸润密切相关n 引。在人类，N G A L 首先是在中性粒细胞中发现的引。 最近有些人在研究乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌等肿瘤细胞系的基因表达时发现了N G A L 过表达啪- 2 2 ，但他 们并没有进一步阐明N G A L 在其中究竟发挥着何种作用。H P V l 8 型
9、E 6 E 7 基因是病毒癌基因，在S H E E 细胞 中，这些基因已经存在，但它并未使细胞癌变，细胞只是停顿于永生化阶段。在此基础上，加促癌物T P A 诱导，S H E E 恶性转化为S H E E C ，而与此同时对应性出现N G A L 的显著异常过表达。很显然，我们所揭示出 来的上述实验事实对充分认识N G A L 在肿瘤发生发展中的作用本质是有帮助的。虽然就此尚不能确认，但 N G A L 基因是人类一种新的癌基因或促癌基因的可能性是很大的。当它被激活后，可能会直接或间接地影 响其下游的一些相关基因的活性发生变化而引起一系列连锁反应，最终造成细胞的恶变。 1 9 9 3 年K j
10、 e l d s e n 等研究发现N G A L 蛋白可以结合基质金属蛋白酶一9 ( M M P 一9 ) 幢3 1 ，提示N G A L 基因在 肿瘤中的功能可能与涮P 一9 的作用存在着某种必然联系。涮P 一9 属于基质金属蛋白酶超家族中的明胶酶 类，其主要作用底物是组织基底膜细胞外基质中的I V 型胶原。近几年来，大量研究提示姗P 一9 可能在 许多恶性肿瘤细胞的浸润转移中发挥着重要的先导作用乜们。最近Y a n 和T s c h e s c h e 等通过体外N G A L 蛋白与M M P 一9 之间的相互作用，同时结合真核细胞基因表达实验证明N G A L 蛋白结合姗P 一9 是
11、在蛋白质 水平上对M M P 一9 活性的一种剂量依赖性保护作用心乳矧。由此推测，N G A L 基因在肿瘤中的功能可能与其 调节保护脚一9 。并以此促进恶变细胞的浸润转移密切相关。我们的研究结果显示，反义封闭N G A L 基 因转录不但可以有效地降低S H E E C 细胞分泌的m l P - 9 的活性，而且与此同时，裸鼠成瘤细胞的浸润行为 也相应地受到了明显抑制拉1 。因此不但从反面为确证N G A L 基因与M M P - 9 之间功能相关增添了一个更有 力的新证据，而且还把N G A L 基因在肿瘤中的作用环节借助于M M P - 9 的中介与肿瘤细胞的浸润行为直接 联系在一起，说
12、明N G A L 基因在肿瘤中的功能确与促进恶变细胞的浸润有关。通常N G A L 蛋白可以与M M P - 9 的前体形式( P r o 一删P 一9 ) 以分子间二硫键和肽段间的疏水作用相互结合在一起形成异源二聚体 ( N G A L P r o M M P 一9 ) 。而N G A L P r o - M M P 一9 可以进一步与金属蛋白酶组织抑制剂( t i s s u ei n h i b i t o ro f m e t a l l o p r o t e i n a s e l ，T I M P 1 ) 以及其他的M M P s 结合在一起形成N G A L P r o 姗P
13、一9 T I M P 一1 或 N G A L P r o M M P 一9 T I M P 一1 删P s 等多元复合物。而在这些复合物中M M P - 9 依然可以被激活，有时甚至活 性更高心肌蹭。由此可见N G A L 蛋白具有在多个层面上调节P r o 一删P 一9 被激活的能力，而实际上这可能是 一种抵消复合物中T I M P l 抑制M M P 一9 活性的作用方式。通常，N G A L 蛋白等与T I M P l 等抑制因子之间 2 5 6 保持着一种动态平衡关系，它们构筑成一个共同的调节体系，借助于对删P 一9 等的调节与恶性细胞 的浸润转移行为相适应。 端粒长度、拓扑异构酶I
14、 I 含量和细胞增殖指数( P I ) 等是表征细胞分裂增殖能力的可靠指标m - - 3 3 1 。我们的研究结果表明，在S H E E C 细胞的有义促进和反义封闭基因表达实验中虽然N G A L 基因的 表达发生了很大的改变，然而各组细胞之间的端粒长度、拓扑异构酶I I 含量和P I 并未因此发生明显 变化，说明N G A L 基因在S H E E C 细胞的分裂增殖方面可能的确不发挥作用或作用不明显埋。 另外，我们通过流式细胞术和激光扫描共聚焦显微镜等技术研究证明，反义封闭N G A L 基因表达可对 S H E E C 食管癌细胞的微丝骨架F - a c t i n 产生明显影响，提示
15、细胞的微丝骨架F - a c t i n 可能是N G A L 基因在 S H E E C 食管癌细胞中发挥功能的另一个作用环节，推测可能与癌细胞在侵袭过程中的变形行为相关联。 细胞微丝骨架由微丝骨架蛋白，即肌动蛋白、肌球蛋白和多种连接蛋白等组成。在非肌肉细胞中，微丝 骨架蛋白在细胞内组成柬状应力纤维，其主要结构成分是纤维型即F 一肌动蛋白，与细胞形态维持、细胞 贴壁粘附与张力支持、细胞运动迁移以及细胞增殖分化等相关信息传递关系密切。有研究表明，伴随着 细胞的恶性转化，细胞内正常的微丝骨架结构往往遭到很大破坏，表现为：束状应力纤维解聚，微丝束 减少或消失，肌动蛋白分子重组形成F - a c t
16、 i n 小体：而荧光染色发现这种F - a c t i n 小体常常呈现散乱云 雾状，且边缘不齐，这些现象与本文的观察结果是一致的。另有研究表明，恶性转化细胞微丝骨架的上 述变化与细胞的侵袭等恶性行为是密切相关的，细胞的微丝骨架系统所遭受的破坏程度越大，细胞的侵 袭性越撮“”1 。而针对肿瘤细胞的这种恶性行为，可通过减少细胞内F - a c t i n 的聚合或改变细胞内 F - a c t i n 骨架的异常分布，来抑制癌细胞的侵袭口7 圳。把本文所获得的诸研究结果联系在一起，有理由 认为反义封闭N G A L 基因表达之所以能够有效地抑制S H E E C 食管癌细胞侵袭，其机制可能与改变细胞微丝 骨架F - a c t i n 有关。细胞微丝骨架F - a c t i n 可能是反义封闭N G A L 基因表达抑制S H E E C 食管癌细胞侵袭的 一个有效靶点。 近年来，许多研究表明微丝骨架系统是细胞内相关信号传递途径的结构支撑，F - a c t i n 在细胞信号 传递
