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1、中山大学 博士学位论文 Sonic Hedgehog信号通路在肝细胞癌侵袭转移中的作用及其机 制 姓名：陈劲松 申请学位级别：博士 专业：外科学 指导教师：汪谦 20100528 中山大学博士学位论文S o n i cH e d g e h o g 信号通路在肝细胞癌侵袭转移中的作用及其机制 S o n i cH e d g e h o g 信号通路在肝细胞癌 侵袭转移中的作用及其机制 专业名称：外科学 博士研究生：陈劲松 导师姓名及职称：汪谦教授 中山大学附属第一医院肝胆外科( 广州，5 1 0 8 0 0 ) 中文摘要 原发性肝细胞癌( 以下简称肝癌) 是人类常见的恶性肿瘤之一，发病率居恶
2、性 肿瘤的第5 位，全球每年有5 0 万以上新发病例，其恶性程度高，预后差，是肿瘤 相关死亡的第3 大原因。在我国，肝癌患者约占全世界肝癌总数的一半，每年约有 1 1 万人死于肝癌，死亡率居恶性肿瘤的第2 位。侵袭和转移是肝癌的显著特征， 也是其预后差的主要原因，因此抑制肝癌的侵袭和转移是肝癌治疗的重要策略。 进一步阐明肝癌侵袭与转移的分子机制有助于发现肝癌治疗的新靶点，也有助于 改善肝癌的预后。 H e d g e h o g ( H H ) 信号通路在胚胎发育期间调控着多种细胞的分化和生长，对 维持成熟器官内环境稳定及维持某些成熟器官中干细胞的功能也起着非常重要 的作用。大量研究已表明异常
3、激活的H H 信号通路与基底细胞癌、萌母细胞瘤、 小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌等多种人类肿瘤的发生 发展密切相关。近年，研究也发现异常激活的S o n i cH e d g e h o g ( S H H ) 信号通路在 肝癌的发生中起重要作用。而且，S H H 信号通路在多种类型细胞运动与迁移的控 制及血管形成中发挥重要作用，在卵巢癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌等 肿瘤的侵袭与转移中亦起重要作用。但是，S H H 信号通路在肝细胞癌的侵袭与转 移中的作用目前尚不清楚。 基底膜( B M ) F F 【I 细胞外基质( E C M ) 是抵抗肿瘤细胞浸润与转移的生理屏
4、障。因 此，降解B M 和E C M 是肿瘤侵袭和转移的重要步骤。基质金属蛋白酶( M M P ) ，尤 T 中山大学博士学位论文S o n i cH e d g e h o g 信号通路在肝细胞癌侵袭转移中的作用及其机制 其是M M P - 2 与M M P 9 是降解E C M 与B M 的主要酶，与肿瘤的浸润与转移密切相 关，在肝癌的侵袭与转移中也起着十分重要的作用。 磷脂酰肌醇( 一3 ) 激酶( P 1 3 K ) A K T 信号通路可通过调控M M P 9 和或M M P 一2 参 与多种肿瘤的侵袭与转移。而P 1 3 K 又是局部粘着斑激酶( F A K ) 的下游底物，F A
5、 K 可通过调控P 1 3 K A K T 信号通路进而调节细胞的增殖、粘附等。此外，F A K 也可 通过调控M M P 2 和或M M P 9 的表达参与多种肿瘤的侵袭与转移。 P 1 3 K A K T 通路是S H H 信号通路所必需，S H H 信号可通过激活P 1 3 K A K T 通路 促进骨髓源内皮祖细胞、成肌细胞、成纤维细胞等的生长、分化。而在肝癌中S H H 信号通路是否是通过调控F A K A K T 信号通路和M M P 的表达而影响肿瘤侵袭和 转移，目前尚不清楚。 本课题首先通过体外实验研究S H H 信号通路被激活或抑制时肝癌细胞迁移 和侵袭及M M P 2 9
6、表达的变化，并探讨S H H 信号通路与F A K A K T 信号通路之 间的交叉对话( c r o s s t a l k ) ，然后检测S H H 信号通路主要成分与F A K A K T 信号通 路关键成分、M M P 2 9 在肝癌组织中的表达及相关性，力图证实S H H 信号通路 在侵袭与转移中的作用及其机制，从而进一步阐明肝癌侵袭与转移的分子机制， 可能为抗肝癌侵袭与转移提供新的治疗靶点，为肝癌预后判断与改善提供新思 路。 第一部分S o n i cH e d g e h o g 信号通路在肝细胞癌迁移和侵袭中的作用 目的： 探讨S o n i cH e d g e h o g
7、( S H H ) 信号通路在肝癌细胞迁移和侵袭中的作用。 方法： 肝癌S K - H e p l 、S M M C 一7 7 2 1 细胞用于本研究。应用r e a l t i m eP C R 检测肝癌 S K - H e p l 、S M M C 一7 7 2 1 细胞中S H H 、P T C H I 、S m o 、G l i 1m R N A 表达情况：应 用r e a l t i m eP C R 和W e s t e r n b l o t 检测细胞转染G l i 1s i R N A 后m R N A 和蛋白的表 达情况；应用细胞粘附实验检测胞粘附能力：应用划痕实验分析细胞运
8、动能力； 应用T r a n s w e l l 迁移和侵袭实验分别分析细胞迁移和侵袭能力；应用M T T 法检 测细胞活力。 中山大学博七学位论文S o n i cH e d g e h o g 信号通路在肝细胞癌侵袭转移中的作用及其机制 结果： 外源性重组S H H - N 能呈剂量依赖性增加肝癌细胞粘附、运动、迁移和侵袭 能力；S H H 中和抗体或c y c l o p a m i n e 能呈剂量依赖性抑制肝癌细胞的粘附、运动、 迁移和侵袭能力；G l i 1s i l A 能明显下调肝癌细胞中G l i 1m R N A 和蛋白表达； G l i 1s i l 喇A 也能明显抑制肝
9、癌细胞的粘附、运动、迁移和侵袭能力；但重组 S H H N 、S H H 中和抗体、c y e l o p a m i n e 及G l i ls i R N A 均不影响肝癌细胞生长。 结论： S H H 信号通路参与肝癌细胞的迁移和侵袭，且这种作用不依赖于其细胞毒 性作用，提示S H H 信号通路可能是肝癌的治疗靶点。 第二部分S o n i cH e d g e h o g 信号通路促进肝细胞癌迁移侵袭的机制研究 目的： 研究S o n i cH e d g e h o g ( S H H ) 信号通路促进肝癌细胞迁移和侵袭的机制。 方法： 应用r e a l t i m eP C R
10、检测m R N A 表达；应用M M P 明胶酶活性实验分析M M P 2 和M M P 一9 活性；利用W e s t e r n b l o t 分析蛋白表达；通过F A Ks i R N A 下调肝癌细胞 F A K 表达；应用T r a n s w e l l 迁移和侵袭实验分别分析细胞迁移和侵袭能力。 结果： 外源性重组S H H - N 能呈剂量依赖性增加肝癌细胞M M P 2 和M M P 9 m R N A 、蛋白表达及活性；而S H H 中和抗体、c y c l o p a m i n e 则呈剂量依赖性减少 肝癌细胞M M P 2 和M M P - 9m R N A 、蛋白
11、表达及活性。M M P 抑制剂G M 6 0 0 1 、 M M P 2 抗体、M M P 9 抗体能抑制重组S H H N 所诱导的肝癌细胞迁移和侵袭。 重组S H H - N 、S H H 中和抗体、c y c l o p a m i n e 均不影响肝癌细胞中T I M P 一1 和 T I M P 2 的表达。 外源性重组S H H N 能呈剂量依赖性增加肝癌细胞中磷酸化A K T ( S e r 4 7 3 ) ( p A K T ) 蛋白表达：而S H H 中和抗体、c y c l o p a m i n e 能呈剂量依赖性减少肝癌细 胞中p - A K T 蛋白表达。但重组S H
12、 H - N 、S H H 中和抗体、c y c l o p a m i n e 均不影响 肝癌细胞A K T 蛋白表达。重组S H H - N 诱导的肝癌细胞迁移和侵袭、M M P 2 和 I I l 中山大学博士学位论文S o n i cH e d g e h o g 信号通路在肝细胞癌侵袭转移中的作用及其机制 M M P 9 的表达及活性均能被P 1 3 K 特异性抑制剂L Y 2 9 4 0 0 2 明显抑制。 外源性重组S H H - N 呈剂量依赖性增加肝癌细胞中磷酸化F A K ( T y r 3 9 7 ) ( p - F A K ) 蛋白表达；而S H H 6 P 和抗体、c
13、 y c l o p a m i n e 则呈剂量依赖性减少肝癌细胞 中磷酸化p - F A K 蛋白表达。但重组S H H - N 、S H H 中和抗体、c y c l o p a m i n e 均不影响 肝癌细胞F A K 蛋白表达。下调肝癌细胞中的F A K 表达能明显抑制重组S H H - N 诱导 的肝癌细胞迁移和侵袭、M M P 2 和M M P 9 的表达与活性及p - A K T 表达。 结论： S H H 信号通路通过上调F A K A K T 信号通路介导的M M P 2 和M M P 9 表达和 活性促进肝癌细胞迁移和侵袭。 第三部分S o n i cH e d g
14、e h o g 信号通路主要成分在肝细胞癌组织中的表 达及其与F A K A K T 信号通路、M M P 2 和M M P 9 的相关性 目的： 研究S o n i cH e d g e h o g ( S H H ) 信号通路主要成分、F A K A K T 信号通路关键成 分与M M P 2 9 在肝细胞癌组织中的表达及其相关性。 方法： 收集2 0 0 4 年7 月至2 0 0 7 年3 月期间中山大学附属第一医院手术切除的2 0 0 例经 病理确诊的肝细胞癌及相应癌旁组织标本，构建组织芯片，应用免疫组化染色检 澳I J S H H 、P T C H l 、S m o 、G l i 1
15、 、F A K 、磷酸化F A K ( T y r 3 9 7 ) ( p - F A K ) 、磷酸化A K T ( S e r 4 7 3 ) ( p - A K D 、M M P 2 和M M P 9 蛋白的表达；应用r e a l t i m eP C R 分析其中3 6 例肝细胞癌组织与癌旁组织中的S H H 、P T C H l 、S m o 、G l i 1 、F A K 、M M P 一2 和 M M P 一9m R N A 的表达。分析各指标与肝癌临床病理参数的相关性。采用 S p e a r m a n S 相关检验分析肝细胞癌组织中各蛋白间的相关性。 结果： 肝癌组织中S
16、 H H 、P T C H I 、S m o 和G l i 1 蛋白和m R N A 表达水平均明显高于相 应的癌旁组织；S H H 、S m o 、G l i 1 过表达与肝癌T N M 分期、血管侵犯及肝内转 移密切相关；P T C H l 与肝癌分化程度有关，而与肿瘤浸润和转移无关；F A K I V 中山大学博士学位论文S o n i cH e d g e h o g 信号通路在肝细胞癌侵袭转移中的作用及其机制 m R N A 和蛋白、p - F A K 蛋白在肝癌中表达明显增高，且与肝癌包膜侵犯、较高的 T N M 分期、血管侵犯及肝内转移密切相关；肝癌组织中p - A K T 过表达与肝癌分 化程度、肝内转移、血管侵犯、T N M 分期及较高的硒6 7 增殖指数密切相关； M M P 2 和M M P 9 在肝癌中的表达水平与肝硬化、包膜侵犯、肝内转移、血管侵 犯和较高的T N M 分期密切相关；肝癌组织中S H H 和G l
