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1、醋酸纤维薄膜电泳法 分离血清蛋白质 4学时 通过实验使学生掌握电泳 的基本原理 熟悉薄膜电泳的基本操作 一、 实验目的掌握醋酸纤维素薄膜电泳法 分离血清蛋白的原理 二、实验原理 1、电泳法 是指带电粒子在外电场的作用下，向 着与其电性相反的电极移动的现象。 如：不处于等电点的蛋白质分子带电荷。 pH=pI OH- pHpI H+ OH- H+ pHpI 蛋白质的兼性离子 阳离子阴离子 CH NH COOHR CH NH 2 COOHR CH NH COOR CH NH 2 COO-R CH NH COOR CH NH 3 COO-R + CH NH COOHR CH NH 3 COOHR +
2、2、电泳技术 是利用样品中各带电粒子在电场中的 迁移速度不同，从而对样品中分子进行分 离、鉴定、纯化和制备。 外在因素 电场强度、 溶液的pH值、 溶液的离子强度 、 电渗现象 影响电泳迁移率的因素 粒子所带净电 荷的量、大小 和形状 内在因素 3、电泳的分类 依据支持物的性质不同： 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜作 支持物的一种区带电泳技术。 该膜具有均一细密微孔结构，对分子移动阻 力小，作为区带电泳的支持物，它具有操作简便、 快速、样品需要量少，应用范围广等优点。不足 之处是分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低
3、，薄膜厚 度小不适于做样品制备用。 血清中含有清蛋白、-球蛋白、-球蛋 白、-球蛋白和各种脂蛋白等。 清蛋白 1球蛋白 2球蛋白 球蛋白 球蛋白 pI 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85-7.3 泳动度 (cm2/s.v) 5.910-5 5.1410-5 4.110-5 2.810-5 1.010-5 分子量 (kD) 69 200 300 90-150 156-300 4、血清蛋白的种类 PH8.6缓冲液中带负电荷 电泳后，将薄膜取出，经染色和漂 洗，薄膜上显示出五条区带，每条带 代表一种蛋白质。 结果示意图： 2 1 清蛋白 三、实验器材与试剂 1.器材： 电泳仪、电泳槽、
4、醋酸纤维素薄膜 (2X8cm)、毛细管、培养皿、载玻片、 粗滤纸、镊子，烧杯，量筒，铅笔。 2.试剂： 新鲜人血清（无溶血现象） PH8.6缓冲液：巴比妥1.66g、 巴比妥钠 12.76g、加水至1000ml，置4冰箱保存。 染色液：氨基黑10B 0.5g、 甲醇50ml、 冰醋 酸10ml、蒸馏水40ml，混匀溶解贮存。 漂洗液：95乙醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水 50ml、混匀。 浸泡 电泳槽准备 点样 电泳 脱色 染色 五、实验过程 1.浸泡：在薄膜粗糙面距一端2cm左右处 用铅笔轻轻划一条直线，表示点样位 置。将薄膜粗糙面向下，浸泡于PH8.6 的巴比妥缓冲液中至少十分钟，使之
5、完全浸泡透。 2. 电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有 缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑 色为负极。每个槽上都有一根可移动的横 杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入 缓冲液中，形成了滤纸桥。两杆之间的距 离调节到略小于醋酸纤维薄膜的长度，点 好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上。 3. 点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层 粗滤纸内吸干多余的液体，然后铺在干净 的平皿盖上(粗糙面点样)，将毛细管在血 清中沾一下，封住上端，在载玻片的一端 均匀涂过，使样品连续、均匀、适量，把 载玻片在薄膜粗糙面上点样位置轻而温和 地印一下。 2cm 4.电泳：将薄膜粗糙面朝下，平行扣于电泳 槽支架
6、的滤纸桥上，膜条点样的一端放在 负极上，膜条与滤纸必须贴紧，平衡5分钟 后通电。调节电压至90-120V左右，电流强 度为0.40.6mA/cm，电泳时间40min-1h。 5.染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色 液中浸泡2-5分钟。 6.漂洗：将膜条从染色液中取出后移置到漂 洗液中漂洗3-4次至无蛋白区底色脱净为止 ，可得到色带清晰的电泳图谱。 五、实验结果与分析 预期结果预期结果 一般的染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带一般的染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带 。从正极端起，依次为清蛋白、。从正极端起，依次为清蛋白、11球蛋白球蛋白 、22球蛋白、球蛋白、球蛋白和球蛋白和球蛋白。球蛋白。
7、 清蛋白 1 2 实际结果实际结果 失败图谱的分析 拖尾状：点样量过多，被分离的血清蛋白不能分离成 5条区带或产生拖尾。 有斑点：点样不均匀，不整齐，导致被分离的区带出 现斑点。 边流现象：点样板蘸取血清一边多一边少，导致区带 分离不清，出现边流现象。 区带模糊：薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离 不成区带。 锯齿状：薄膜用滤纸吸水过度（薄膜上出现白 斑）或未及时搭桥，导致薄膜过于干燥，使区带成 锯齿状。 区带倾斜：薄膜搭载滤纸上的位置歪斜，弯曲 ，与电流方向不平行，或点样一边多一边少，区带 容易泳斜。 区带重叠：在染色固定前，薄膜与薄膜之间重 叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。 区
8、带过密：电泳时电压，电流过小或时间不够 ，造成区带未分离。 六、临床意义 血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分，含量为 6080g/L,大部分由肝脏合成。 正常值： 蛋白质 血浆中浓度 白蛋白 4050g/L 1-球蛋白24g/L 2-球蛋白 49g/L -球蛋白611g/L -球蛋白1317g/L 肝炎白蛋白、1、2 和球蛋白降低， 球蛋白升高； 肝硬化白蛋白、1、2 和球蛋白下降明显， 球蛋白极度升高； 肾病综合征 白蛋白降低， 2 和球蛋白升高。 多发性骨髓瘤：白蛋白降低，球蛋白升高， 和 球蛋白区带之间出现“M”带。 急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭：白蛋白降低， 1、2 和球蛋白升高；
9、 慢性活动性肝炎、肝硬化：白蛋白降低，、球蛋白 升高； 急性炎症：1、2球蛋白升高； 慢性炎症：白蛋白降低、2、球蛋白升高； 红斑狼疮、类风湿关节炎：白蛋白降低，球蛋白显著 升高； 多发性骨髓瘤：白蛋白降低，球蛋白升高， 和 球蛋白区带之间出现“M”带。 七、注意事项 1.保持薄膜清洁， 勿用手指接触薄膜表面，以免油污 或污物沾上，影响电泳结果。 2.加样时一定要呈直线、垂直、分布均匀，这样泳动 的区带整齐、不歪。 4.染色的同时也是蛋白质的固定，所以，不要将很多 蛋白条重叠在一起。 3.注意薄膜正负极不要搭反，注意簿膜的正反不要放反。 放的时候注意血样不要与滤纸接触了。 5.通电完毕时，必须
10、切断电源，以防触电事故。 注意事项 1.保持薄膜清洁，务必戴上塑料手套，勿用手指接触薄膜表面，以免油污或污物 沾上，影响电泳结果。 2.注意醋酸纤维膜的质量，至少浸泡10分钟，浸泡很久仍有大块白色硬点者须弃 之不用。 3.加样时一定要呈直线、垂直、分布均匀，这样泳动的区带整齐、不歪。 4.电泳槽两边的缓冲液应保持液面在同一水平面上，槽里的缓冲液要保持清洁。 5.电泳电压大小，时间长短与缓冲液的离子强度都有一定的关系。一般电流约0.4 0.6mA/cm,电压110160V，通电时间4060min。电压高，电流大，电泳速 度加快，时间可缩短，但薄膜上蒸发严重，电泳图谱出现条痕，因此不能无限增 大电流。 6.使用培养皿时要润洗。 7.染色的同时也是蛋白质的固定，所以，不要将很多蛋白条重叠在一起。 8.应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或 造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。 9.注意薄膜正负极不要搭反，注意簿膜的正反不要放反。放的时候注意血样不要 与滤纸接触了。 10.通电完毕时，必须切断电源，以防触电事故。 八、思考题？ 1.电泳时，点样端为什么要置于电场的负 极？
