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1、华中科技大学 硕士学位论文 氟虫腈对PC12细胞毒作用及其机制的初步探讨 姓名：胡雄飞 申请学位级别：硕士 专业：卫生毒理学 指导教师：李龙 20090501 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 氟虫腈对氟虫腈对 PC12 细胞毒作用及其机制的初步探讨细胞毒作用及其机制的初步探讨 硕士研究生：胡雄飞 指 导 老 师 ：李 龙 副教授 摘摘 要要 一、前言一、前言 近年来，我国农药使用量有增无减。随着 2007 年甲胺磷等高毒的农药被全面禁 用，中等毒性的新型农药使用量均大幅上升，如氟虫腈在我国中部地区的使用量已经 明显增多。氟虫腈
2、，商品名为锐劲特，属于苯基吡唑类杀虫剂，与吡啶类杀虫剂相比， 氟化苯基吡唑类农药杀虫机制独特，具有杀虫谱广的优点，并且对有机磷、氨基甲酸 酯类、拟除虫菊酯类农药有抗药性的害虫毒性效果更为明显。氟虫腈作为一种中等毒 性杀虫剂，生物活性很高，是一种高效农药，对害虫具有胃毒、触杀和内吸作用，并 且有效剂量与拟除虫菊酯类农药相当，其作用机制在于干扰昆虫 氨基丁酸控制的 氯化物代谢，致使昆虫神经痉挛、麻痹致死。国际上喻其为新一代高科技杀虫剂，是 第 3 代新烟碱农药。但氟虫腈作为一种新型农药，也具有其致命的缺点，即氟虫腈具 有较高的生态毒性，特别是对蜜蜂和水生生物（如虾、蟹）的毒性高，因此不宜在蜜 蜂和
3、虾蟹养殖地区使用。 活性氧（reactive oxygen species, ROS）是一种重要的氧自由基，主要包括过氧化 氢和超氧化物阴离子。在生理条件下，机体内的自由基处于平衡状态，浓度很低，不 仅不会对机体造成损伤，而且还具有重要的生理功能。但是，当环境中的物理因素或 外源化学物质直接或间接诱导机体产生了大量自由基，并且超过了机体的清除能力， 或内源性自由基产生和清除失去平衡，就会使机体处于氧化应激（oxidative stress）状 态，进而使机体受到损害。活性氧与 Ca2+浓度、调控蛋白 Bcl-2 含量等相关，并和它 们一起影响着细胞凋亡。 凋亡蛋白 Bcl-2 是原癌基因 Bc
4、l-2 表达的一种蛋白质，对细胞凋亡的发生具有抑 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 制作用。Bcl-2 蛋白抑制细胞凋亡的机制目前仍然不是很清楚，但大多认为与 Bcl-2 蛋 白具有的细胞内抗氧化作用以及对钙离子跨膜运动功能的抑制作用有关。 本研究以大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞（PC12 细胞）为模型，研究 ROS 和 Bcl-2 蛋白 在氟虫腈对细胞毒作用中的含量变化，为了解氟虫腈对体外培养细胞的毒作用机制提 供实验依据。 二、方法二、方法 实验分组为对照和 7.8110-7、3.1310-6、1.2510-5、5.0010-5mol
5、/L 四个剂量组， 研究方法与内容如下： 1. MTT 法测定以上四个剂量组作用 12h、24h 和 48h 后对 PC12 细胞存活率的影响 2. 形态学方法检测 3.1310-6、1.2510-5、5.0010-5mol/L 三个剂量组对 PC12 细胞 凋亡与坏死的影响 3. 流式细胞术法测定 3.1310-6、1.2510-5、5.0010-5mol/L 三个剂量组对 PC12 细 胞凋亡率的影响 4. 免疫荧光细胞化学法测定 3.1310-6、1.2510-5、5.0010-5mol/L 三个剂量组作用 PC12 细胞 24h 后对 Bcl-2 蛋白含量的影响 5. 比色法测定 3.
6、1310-6、1.2510-5、5.0010-5mol/L 三个剂量组作用 PC12 细胞 4h、 8h、16h、24h 对 ROS 含量的影响 三、结果三、结果 1. 对细胞存活率影响的研究结果表明，四个剂量组在作用 PC12 细胞 12h 均无明显毒 性作用， 作用 24h 和 48h 后各组细胞存活率即明显低于对照组， 差异有统计学意义。 2. Hoechst-PI 双参数法对细胞凋亡进行检测，荧光显微镜下观察到 3.1310-6mol/L 剂 量组凋亡细胞数明显多于对照组，而 5.0010-5mol/L 剂量组死亡细胞数明显高于对 照组。 3. 流式细胞仪对不同剂量组细胞凋亡率及死亡率
7、进行检测。5.0010-5mol/L 剂量组细 胞死亡率明显高于对照组，差异有统计学意义；3.1310-6mol/L 剂量组细胞凋亡率 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4 明显多于对照组，差异有统计学意义。 4. 免疫荧光细胞化学法测定 PC12 细胞 Bcl-2 蛋白表达，通过荧光显微镜对不同染毒 剂量组进行荧光强度检测，3.1310-6mol/L 剂量组荧光强度明显低于对照组。 5. 对不同剂量组染毒 4h、8h、16h 和 24h 后，分别对各组细胞内 ROS 含量进行检测。 3.1310-6mol/L 剂量组在染毒 4h
8、后 ROS 含量明显升高，较对照组差异有统计学意 义； 而 5.0010-5mol/L 剂量组在染毒 24h 后 ROS 含量明显下降， 较对照组差异有统 计学意义。 四、结论四、结论 氟虫腈是一种中等毒性的农药，具有神经毒性作用，它能够使体外培养的 PC12 细胞存活率下降。在低剂量通过影响 Bcl-2 蛋白表达，使细胞内 ROS 含量升高，进而 促进细胞凋亡的发生；在较高剂量时可使细胞不经过凋亡途径，而直接使大量细胞发 生死亡，死亡的具体机制还有待进一步研究。 关键词关键词： 氟虫腈；PC12细胞；活性氧；Bcl-2蛋白；细胞凋亡 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科
9、 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5 The Toxicity and Mechansim of Fipronil on PC12 Cells Candidate: Xiongfei Hu Supervisor: Vice Prof. Long Li Abstract Introduction Over the past few years, the application of pesticides is more and more in our country. While the pesticides with high toxicity are completely banned,
10、 the use of pesticides with middle toxicity increased substantially, such as fipronil applied in the central region of our country. Fipronil, named “Regent”, belonging to phenyl pyrazole insecticides, is a broad-spectrum insecticide compared with the pyridine insecticides, especially for the pests t
11、hat cannot been killed by organic phosphorus, carbamate and synthetic pyrethroid pesticides. It is a pesticide of middle toxicity and high biological activity. The toxicity of fipronil is considerable with pyrethroid pesticides. It acts on gamma amino butyric acid (GABA) receptors to prevent the inh
12、ibition of GABA. As a new insecticide in the world, a distinc disadvantage is that fipronil is highly toxic to aquatic organisms, such as shrimp and crab, so it is can not be used in these areas. Reactive oxygen species (ROS) are important free radicals including oxygen ions and inorganic peroxide.
13、It is reported that appropriate level of ROS can inhance the immune system, while excess ROS are harmful for organisms. It is imposed oxidative stress in organisms when exc ess free radicals are directly or indirectly induced by environmental factors or exogenous chemical substances. Apoptosis is in
14、fluenced by the level of ROS, expression of Bcl-2 protein and concentration of Ca2+. Bcl-2 protein is a protein related to apoptosis, expressed by Bcl-2 gene, can reduce the rate of cell apoptosis. The specific mechanism of Bcl-2 protein is still not clear now, but 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大
15、学 硕 士 学 位 论 文 6 most resrarchers believe that Bcl-2 protein is related with anti-oxidation and inhibion of Ca2+ movement. This study aims to investigate the level of ROS and the expression of Bcl-2 protein in PC12 cells that are treated with fipronil. At the same time, insight of the toxicity mechan
16、ism may be gained. Methods There were five groups in this experiment, control group and four dose groups. The dose groups were 7.8110-7, 3.1310-6, 1.2510-5 and 5.0010-5mol/L. 1. The effect of fipronil on the survival rate of PC12 cells of these four dose groups after 12h, 24h and 48h treatment was detected by Methyl Thiazolyl Tetrazolium (MTT). 2
