《新型肝癌靶向性cmyc反义rna表达载体的构建及对人肝癌细胞的抑制作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《新型肝癌靶向性cmyc反义rna表达载体的构建及对人肝癌细胞的抑制作用（61页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、山东大学 硕士学位论文 新型肝癌靶向性c-myc反义RNA表达载体的构建及对人肝癌细胞 的抑制作用 姓名：曲守方 申请学位级别：硕士 专业：免疫学 指导教师：孙汶生;马春红 20030506 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本 文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：幽当日期： 竺丕! ：! 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规
2、定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他 复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：必垄导师签名：期：2 型主：生! f 山东大学硕士论文 新型肝癌靶向性c - m y c 反义R N A 表达载体的构建 及对人肝癌细胞的抑制作用 中文摘要 目的： 构建c - m y c 反义R N A 表达载体和新型肝癌靶向性四元复合物基因定向转移系统， 探讨c m y c 反义R N A 对人肝癌细胞内靶基因表达、细
3、胞凋亡诱导及细胞周期等生物学 活性的作用；并研究其在荷瘤裸鼠模型体内对肝癌细胞的抑制作用。 方法： 1 c - m y c 反义R N A 表达载体p c D N A 3 卜8 s c m y c 的构建 选用p c P N A 3 1 ( 一) 真核表达载体，用X b a I 和H i n d l I I 双酶切携带有目的基因的质 粒p c M Y C ，获得1 3 5 6 k b 的c m y ce D N A ：同时将p c D N A 3 1 ( 一) 表达载体线性化。G e l E x t r a c t i o nK i t 将两者回收纯化并用T 4 D N A 连接酶进行连接，转
4、化感受态细菌D H 5a ， 随机挑选抗性菌落。酶切分析方法筛选出阳性重组克隆。设计c m y c 引物( 扩增产物 为7 8 4 b p ) 上游：5 G C T C T A G 从T G C C C C T c A A C G T T A G C T T3 ；下游：5 G c T C T A G A c A G A G T c G c T G c T G G T3 ，用P C R 方法鉴定出阳性重组克隆。然后进行D N A 测序 和同源性分析。 2 c - m y c 反义R N A 靶向肝癌的体外抑制实验研究 2 1 四元复合体基因转移系统的建立 细胞免疫组织化学试验，检测H e p G
5、 2 2 1 5 细胞和H e p G 2 细胞表面E G F R 的表达情 况。利用肿瘤细胞表面特异高表达的表皮生长因子受体E G F R ，设计合成针对E G F R 的 1 6 肽G E 7 作为配体寡肽( L i g a n do l i g o p e p t i d e ，L O P ) ，合成流感病毒血凝素功能域 2 0 肽H A 2 0 作为内吞小体释放寡肽( E n d o s o m er e l e a s i n go l i g o p e p t i e ，E R O P ) ，同时合 成多聚赖氨酸( p o l y l y s i n e ，P L ) 为多聚阳离
6、子多肽( P o l y c a t i o n i cp o l y p e p t i d e ，P C P ) ， 将E R O P 、L O P 分别与P C P 共价连接为多肽混合物。多肽混合物与质粒D N A 按1 ：1 混合， 制备E G F R 介导的四元复合体基因转移系统。 2 2 两种基因导入方法体外基因转染率的比较 含E G F P 基因的报告质粒p E G F P N 1 分别经脂质体L F 2 0 0 0 及G E 7 四元复合体转染 H e p G 2 2 1 5 细胞，3 天后用流式细胞仪检测分析绿色荧光蛋白E G F P 的表达率。 山东大学硕士论文 2 3c
7、- m y c 反义R N A 瞬时表达对肝癌细胞的体外抑制作用 用四元复合体基因转移系统将重组反义R N A 表达载体p c D N A 3 卜a s c m y c 体外瞬 时转染H e p G 2 2 1 5 和H e p G 2 受体细胞，3 天后，流式细胞仪检测肝癌细胞内靶基因表 达、细胞凋亡率并分析细胞周期。同时，以正义表达载体、空载体转染肝癌细胞，并 以未转染的肝癌细胞为对照。M T T 法检测c m y c 反义R N A 对肿瘤细胞H e p G 2 2 1 5 的生 长抑制作用。 2 4c ，m y c 反义R N A 稳定表达对肝癌细胞H e p G 2 生长的抑制作用
8、反义R N A 转染对数生长期H e p G 2 细胞，2 4 h 后，培养基中加入3 8 0ug m l 的新霉 素，3 4 周后筛选出可长期传代并稳定表达c m y c 反义R N A 的肝癌细胞克隆。绘制稳 定转染细胞系H e p G 2 a s c m y c 的生长曲线，研究稳定表达的c - m y c 反义R N A 对肝癌细 胞的抑制作用。同时，以亲本H e p G 2 细胞为对照。 3 四元复合体介导c - - m y c 反义R N A 对荷瘤鼠体内肝癌细胞的靶向抑制作用 裸鼠腋窝皮下。注射1 i 0 8 个m 1H e p G 2 2 1 5 细胞悬液0 ，I m l ，制
9、备荷瘤动物模 型。裸鼠腋窝皮下注射肝癌细胞悬液0 i m l 。1 0 天后，肿瘤直径为0 5 c m 时，瘤内注 射含0 2 u f f 反义R N A 质粒( p c D N A 3 卜a s c m y c ) 的四元复合体，以生理盐水注射组和空 载体注射组为对照。每周注射一次，4 周后处死动物，取瘤体，测其直径，观察c m y c 反义R N A 对肝癌细胞移植瘤生长的抑制作用。免疫组化方法观察肿瘤组织切片，研究 c - m y c 反义R N A 体内抑制肝癌细胞c m y c 表达的作用。为增强c m y c 反义R N A 的抑制 作用，探讨c - m y c 反义R N A 联
10、合I F N 一q 对肝癌细胞的抑制作用。 结果： 1 成功构建针对原癌基因c - - m y c 的反义R N A 表达载体 将1 3 5 6 k b 的c m y cc D N A 片段和酶切后载体p c D N A 3 1 ( 一) 进行连接转化，随机小 量扩增抽提质粒，X b a l 和H i n d I I I 双酶切，1 琼脂糖凝胶电泳证实目的基因成功插入。 P C R 鉴定其连接的正确性。对p c D N A 3 卜a s c m y c 进行测序和同源性分析，结果显示 该序列包括编码c m y c 蛋白的编码区。 2 四元复合体介导的转染率显著高于脂质体介导的转染率 免疫组化试
11、验表明，H e p G 2 2 1 5 细胞和H e p G 2 细胞表面有高表达的E G F R 。含E G F P 基因的报告质粒p E G F P N 1 分别经脂质体L F 2 0 0 0 及G E 7 四元复合体转染H e p G 2 2 1 5 细胞。流式细胞仪检测E G F P 表达，结果显示，四元复合体包被的p E G F P N 1 转染率较 2 由衷丈攀颀士论文 L F 2 0 0 0 介导的转染率高( 4 4 9 5 V S3 3 0 0 】j 6 ) 。 3 c - m y c 反义R N A 瞬时表达体外抑制肝癌绷跑的生长 M T T 法硷测避示，爱义袭运载镩与对照缱
12、稳逢，霹皴镄亲l 耱瘗维藏生长。e m y c 爨自表达的检测表明，转染c - m y c 反义R N A 的肝癌细胞H e p G 2 2 1 5 ，c m y c 蛋白表达 水平为5 3 2 3 ，明显低于正义转染组( 9 4 7 5 ) 、空载体转染组( 9 1 3 8 ) 和非转染缀 ( 8 3 2 1 ) 。缀熬溺期分辑显示：爱义R N A 转絷的缨庭，穗溪G O G 1 期停滞( 7 t 4 l 糍) ， S 期的细胞数为1 8 9 2 ，明最低于正义转染组( 2 7 7 3 ) 、空载体转染组( 2 2 0 6 ) 和 非转染组( 2 4 3 0 ) 。细胞凋亡率分析显示：反义R
13、 N A 缀的凋亡诱导攀为4 4 9 ，麓于 正义转染缰( 2 7 5 镌) 、空载俸转染缝( 2 2 筑) 稔未转絷缀( z 1 繇) 。爱义骶A 转漆缝 与未转染组相比，p O 0 5 。同时，转染反义表达载体的肝癌细胞H e p G 2 ，c m y c 蛋臼表 达水平为6 9 ，0 3 ，明显低于正义转染组( 1 0 2 ，5 1 ) 、空载体转染组( 8 9 ，9 7 ) 和非转染组 7 6 0 4 ) 。纲藏瞒期分车厅显示：爱义R N A 转染戆涎餐2 缀缒，崮魂G O G 1 麓箨洚。 4 c - m y c 反义R N A 稳定表达体外抑制肝瘸细胞的生长 反义R N A 转染对
14、数生长期H e p G 2 细胞，培养基中加入新霉素，3 - 4 周后筛选出可 长期传徒并稳建袋达e 一强y 发义R N A 静蠡于瘸缁藏壳隆。瀚辩，鼓亲本H e p G 2 绥藏为对 照。对数生长期细胞，以1 1 0 4 个m l 按种9 6 孔培养掇中，每日取各种克隆细胞株3 孔满优计数，逑续7 天，绘制生长曲线。绪栗显示，稳定表达c m y c 反义R N A 的脬癌 霸稳生长速囊与亲本细纛稻滋鹤显减馒，程绩养的第7 天，缀瑰生长静螽l 这4 8 。 5 肝癌靶向性c - - m y c 反义R N A 显著抑制荷艚鼠人肝癌纲胞穆植瘤生长 c - m y c 反义R N A 可以抑制群移
15、植瘤的生长。结果表明：裸鼠腋窝皮下注射肝癞细 藏慧液0 1 m l 。1 0 天后，释瘸盔径为0 5 c m 孵，0 2 # g 鬣，每鼹浪瓣一次，4 次聪， C - m y c 反义R N A 对照组结节赢径( 0 7 7 c m 士0 0 6 ) 显著低于生理盐水对照组( 1 3 3 c m 0 1 5 ) 和空载体对照组 1 4 3 c m 0 2 3 ) 。反义R N A 转染组与未转染缀相比，p O 0 5 。 联合干扰素对照缀豹瘩俸奁径为( 0 5 0 c m 主毋0 5 ) ，联合于挽素经与葭义R N A 转潦缀稳 比，p O 0 5 ，因此抑瘤效果更好。免疫组化显示，c m y
16、 c 反义R N A 对照组c m y c 鬣白 的液这低于生瑕盐水对照组。 绪论： 本研究成功构建了c - m y c 反义R N A 表达载体( p c D N A 3 卜a s C m y c ) ；建立了种 藜熬数瓣瘿缨簸耱箕裹表达豹E G F R 穷导豹反义勰盎掰癌靶囊缝基因转移系统，实现了 山东大学硕士论文 在肿瘤组织中的特异性转移。瞬时转染和稳定转染试验证明c m y c 反义R N A 能够抑制 人肝癌细胞系H e p G 2 2 1 5 和H e p G 2 内c m y c 蛋白的表达，阻遏细胞的生长增殖，使细 胞大部分处于G O G I 期；体内试验证明c m y c 反义R N A 可以抑制肿瘤细胞的生长。首 次证明c m y c 反义R N A
