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1、内蒙古医学院 硕士学位论文 抗菌肽CM4基因的克隆及真核表达载体构建 姓名：包散丹 申请学位级别：硕士 专业：免疫学 指导教师：新燕;李存保 20080501 缩略语 A B P b p E D T A I 眦 B P C R r p m S D S S O E 法 T a q I H 8 x g a l 英文全称 英文缩略语表 A n 血l i c m b i a lp e d e s B 8 p 8 i r 中文全称 抗菌肽 碱基对 乙二胺四乙酸 I p m p y l B D t l l i 诎姊y 瑚i d e异丙醇一B 硫代半乳糖苷 P o 枷e 疆S ec h a 岫r e t i
2、 m u n dp e rm i 删t e d i u md o d e c o y Is a l i 舱 聚合酶链式反应 每分钟转数 十二烷基磺酸钠 g e n es p l i c i n gb yo v e d 印p i I l ge x t e 鹏如m 重叠区扩增基因拼接法 弧e 面o u sa q u a t i c u 8 ( D N Ap o 驷e 瑚e ) 噬热水生菌D N A 聚合酶 s h y d 卿e t I I l 锄i n o m e t l l 髓e三羟甲基氨基甲烷 5 一b 瑚一4 一c h l o m 一3 一i n d o l y l p D 一5 一溴一4
3、氯，3 一吗I 哚p D 半孚L g a l i d e糖苷 内蒙古医学院学位论文原创性声明 郑重声明：本人所呈交的学位论文是在导师指导下，独立进行研究所取得的研究成 果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文内容不包含其他个人或集体已经公开发 表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确 方式标明。本人学位论文与资料若有不实，愿意承担一切相关的法律责任。 论文作者签名巳数 加7 年月夕乙日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学院有关保留、使用学位论文的规定，同意学院保留并向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版。学院享有发表、复制、查阅、借阅及申请专利
4、等权 利。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。同时本人保证：毕业 后发表、使用学位论文以及结合学位论文研究课题再撰写的文章，作者署名单位一律为 内蒙古医学院。 指导教师签名鱼整 j 矽苫年j 月罗口日翌日 盘 月 召一 名 年 签 者作 文沦 C I o I I i n ga n dE u k a r y o t i cE x p r e s s i o nV 砒rC o n s t n l 娟o no f 舢1 t i m i c r o M a Ip e p 廿d eC M 4G e 玳 A b s l 【r a c t A n t i 咄砒i a lp e p d d
5、e 8 ( A M P s ) ，a 阳a 蠡瑚丑yo fh o s t d e f e 璐ep e p 血k 啪8 to fw h i c h a 弛g e 鹏一e n c o d e d 锄dp r o l d u c e db yl i v i n go r g 疵s 璐0 fa u 啪燃e ya r ep 0 8 i 6 v e l yc l l a 谐e d 锄dh a v eb m a ds p e c 妞腿锄t i m i c r o b i a la c d v i 哆a g a i 璐tb a c t e r i a ，讥8 髓，a n df u n 瘿T h e yh a
6、v e b e e ns t u d i e df o rt l l e i r 谢伽sr o l i ni m l a ei m 姗I l i t ) ，肌dt l l e i rp o t e n t i a l l ye x t e 璐i v e 印p l i c a - t i o n 虢wa 曲b i o t i c s 试t l ln e wr I l 0 H d e s0 f a c d o 璐I I lt h i ss t u d y ，C M 4g e n e 舶m B o I I l b y 】【m 撕 w 嬲锄p l 访e dv i as p H c i I l gb y
7、o v e r l 印p i n ge x t e 璐i o n ( S O E ) m e t h o d ，c l 仰e di n t op M D l 9 一T v e c t o ra n ds e q u e n c e d F i 腿u y ，吐l eg e 北w 8 ss u c c e s s f p 坶i I l 枷e di n t 0y e 蠲t 唧r ：e 8 s i o nV e c t o r p P I C 施A K e y 啪r d sA n 妇I i c m b 试p e p d d eC M 4G e 北s o E 眦t I l o dE u k a r y
8、砸cE 【p 髑s i o n V e c t o rC o n s t l l l c t i o n 抗菌肽C M 4 基因的克隆及真核表达载体构建 近年来抗生素的滥用导致了耐药菌株的出现，使得细菌性疾病的防治再次成为人类 的难题。一种全新抗菌药物的开发已经成为当代微生物学家、医药学专家的主攻课题。 抗菌肽以其相对分子量小，广谱高效抗菌活性及独特的抗菌机制使病原菌不易产生耐药 性突变【1J ，有望成为最具开发前景的抗生素替代品。 抗菌肽( A n t i m i c m b i a lp e p t i d e sA B P ) 是生物体内经诱导产生的一类具有生物学活性 的小分子多肽口 。
9、最早的抗菌肽是1 9 8 0 年瑞典科学家B o m a n 等从惜古比天蚕蛹中发 现的o ? J 。此后人们相继从家蚕、柞蚕、蚊虫等昆虫体内分离获得的抗菌肽有7 0 0 种左 右【4 o 其中，抗菌肽C M 4 是由张双全等从中国家蚕中发现的。具有两亲性仅螺旋结构， 属于C e c m p i n 家族，含有3 5 个氨基酸残基，分子量约为3 8 K D ，有很强的杀菌能力1 ，它 对革兰阳性和阴性菌、真菌、厌氧菌、螺旋体、分枝杆菌、包膜病毒、原虫、癌细胞等均有明 显的杀伤作用而不破坏正常细胞MJ 。天然抗菌肽的产量非常低，合成抗菌肽的价格又非 常昂贵，因此通过基因工程技术生产抗菌肽具有广阔
10、的应用前景。 通过基因工程获得抗菌肽时，可选择原核表达和真核表达两类。其中，原核表达系 统具有表达量高、生长快、成本低等优点，缺点是不能分泌蛋白质，无翻译后修饰功能。 如果利用原核表达系统来获得抗菌肽就会出现由于表达的蛋白具有抗菌活性而杀死宿 主菌的现象L 7 | 。所以在原核中表达时采用融合表达方式。如谢维首次合成了家蚕抗菌 肽C M 4 基因，并将其克隆到金黄色葡萄球菌A 蛋白与I g G 亲和结构域z z 的融合表达载 体中，得到P e z z 3 1 8 一C M 4 质粒，以此质粒转化大肠杆菌H B l 0 1 ，得到融合表达的蛋白Z z c M 4 ，但表达产率不够理想旧Jo 所以
11、人们开始尝试抗菌肽在真核细胞中进行表达，如 酵母表达系统。酵母表达系统的优点是表达量高、分泌型易于纯化，有部分翻译后修饰 功能J 。一般采用巴斯德毕赤酵母菌表达系统进行分泌表达。王秀清等对六种天蚕素 类基因进行研究得到了能够在毕赤酵母菌中高效分泌表达的天蚕素，并将其应用于鸡饲 料的抗菌工程中0 | o 此外，张杰等采用P i c h i ap a s t o r i s 系统成功地分泌表达了具有生物 活性的抗菌肽C M 4 【9 】o 但是它们用的载体为p P I c 9 ，该载体操作繁琐，是单一拷贝，不能 高水平表达外源蛋白。而本文使用的载体p P I C z 仅A 不需要氨苄抗性筛选，筛选
12、标记为 z e o c i n ，且载体小，易操作，能高水平表达外源蛋白u l lo 凼苤直匡堂瞳亟班塞生堂焦迨塞( 塑璺堡2 鉴于抗菌肽C M 4 在真核细胞中表达的成功范例，本文将以扩增出C M 4 基因片段与 真核表达载体p P I c 孤A 连接得到重组载体p P I c z 以一c M 4 ，为其在毕赤酵母菌中分泌表 达打下基础。 l 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 主要试剂 2 T a qP C RM 鹊t e rM i x ( 天根生化科技有限公司) 表达载体p P I C Z a A ( I I l 、r i t m g e n 公司) 感受态大肠杆菌T O P l O
13、( 天根生化科技有限公司) 限制性核酸内切酶N o t I 、E c o R I ( T a K a R a 公司) T 4D N A 连接酶( T a K a R a 公司) D 也，0 0 0D N AM a r k e r ( 瞰a R a 公司) Z e o c i n 购于I n v i t r o g e n 公司 质粒P M D 一1 9 一T ( T a K a R a 公司) 普通琼脂糖凝胶D N A 回收试剂盒( A x Y G E N 公司) 小量质粒提取拭剂盒( A X Y G E N 公司) 1 1 2 主要仪器设备 高速低温离心机( 美国B a c k t 姗公司)
14、 一7 0 c C 超低温冰箱( 美国T h e 硼oF o m a 公司) 多通道分子成像系统( 美国n u o r SM A X 公司) P C R 仪( 德国E p p e n d o I f 公司) 电泳仪系统P O W E R P A C 3 6 0 ( 美国B I O R A D 公司) 电热恒温水浴箱( 德国m e 哪e r 公司) 恒温摇床S P H 一2 1 0 A ( 美国S H I P I N G 公司) 超净工作台B C M 一1 0 0 0 ( 中国苏州A I Rr I E C H 公司) 超纯水器M i u i Q ( 美国B i o c e l 公司) 1 1 3
15、 试剂的配制 ( 1 ) L B 液体培养基的组成： 蛋白胨：l 酵母浸出粉：0 5 N a C I ：1 凼苤直医堂瞳亟婴塞生堂焦迨塞f 垫墨生2 ( 2 ) 低盐L B 液体培养基的组成： 蛋白胨：l 酵母浸出粉：O 5 N a C I ：O 5 ( 3 ) S D S 溶液的组成： N a O H ：1m o L L S D S ：2 ； ( 4 ) 裂解液组成： 蔗糖：0 3 m o L Ls H C I ：2 5 姗彬L ( P H8 0 )E D T A ：2 5 栅彬L 溴甲酚氯：O 0 2 1 2 方法1 2 1 2 1 引物设计与目的基因合成 本文根据已知家蚕抗菌肽C M 4
16、 成熟肽段的氨基酸序列1 3 】，选用酵母偏爱的密码 子 1 4 3 设计两对引物。引物由上海生物工程公司合成，合成总量为2o D ，根据说明书将引 物配制成浓度为1 0 斗m o L L 溶液。 第一对引物序列如下： 上游引物P 1 ： 5 A G A T G G A A G A T l ：- I I C A A G A A G A T C G A G A A G G T O G G T C A A A A C A T C A G A G A C G G T A T C G T3 7 下游引物P 2 ： 5A A 7 I A G T A G C A G C 7 I T G A C C G A C G A C A G C G A C A G C T G G A C C A G C C I T G A C G A T A C C G 婴! g 三7 上述引物P 1 和
