《新型超氧化物歧化酶生物传感器的研制及清除超氧阴离子自由基药物的筛选方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《新型超氧化物歧化酶生物传感器的研制及清除超氧阴离子自由基药物的筛选方法（87页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、四川大学 硕士学位论文 新型超氧化物歧化酶生物传感器的研制及清除超氧阴离子自由 基药物的筛选方法 姓名：冉良骥 申请学位级别：硕士 专业：药物分析 指导教师：吕太平 20030501 中文摘要 新型超氧化物歧化酶生物传感器的研制 及清除超氧阴离子自由基药物的筛选方法 摘要 导师：吕太平教授 研究生：冉良骥 超氧阴离子( o j ) 是机体代谢过程中最先产生的自由基，也是氧 自由基的家族中最为重要的自由基，它不仅与多种疾病密切相关，而 且可以经过一系列反应生成其它有害氧自由基，因此在自由基生物学 理论中具有特别重要的意义。 为了考察和比较药物对超氧阴离子的清除能力，本文设计了一种 新型的超氧化物
2、歧化酶传感器，以邻苯三酚的自氧化作为超氧阴离子 的发生源，同时以光纤氧传感器监测自氧化速度，传感器中预置的固 定化铜锌超氧化物歧化酶的响应作为内标，通过对比加入药物前后自 氧化速度的变化情况，可获得药物清除超氧阴离子自由基能力的相关 信息。 整个课题包括以下几个部分。 第一部分、光纤氧传感器的研制 本文以T E O S 、M T E O S 共水解，通过溶胶凝胶法制膜固定自制的 荧光试剂R u B P P P ，制备了新型的光纤氧传感器，并对制膜方法进行优 化。结合S t e m - V o l m e r 曲线的绘制及样品的测定，对方法进行了全面评 价。所制备的光纤氧传感器在较大的浓度范围内
3、( 气态氧0 - 1 0 0 、 溶解氧0 5 5r a g 1 3 3 1 m g l ，2 9 。C ) ，测定结果有良好的线性相关 ( r O 9 9 9 0 ) ，且响应迅速( T 9 5 09 9 9 0 ) a n dh a d af a s tr e s p o n s et i m e ( T 9 5 9 9 天津化学试剂研究所) ； 1 1 1 i B 物分析专业蝴粗硬士研究生论文 甲基。三乙氧基硅烷( M T E O s 。9 9 成都今天化工有限公司) ： 四甲氧基硅烷( ，r M O S ，9 9 成都今天化工有限公司) ； 甲基一三甲氧基硅烷( M T M O S ，
4、9 9 成都今天化工有限公司) ： T r i t o n X 一1 0 0 ( 9 9 B i o m o l 公司，华美生物工程公司分装) ； 实验用水为双重蒸馏水，实验用气取自钢瓶，N 2 C 9 5 ) ，0 2 ( 9 0 ) ： 二、方法与结果 1 由B P P P 合成R u B P P P 荧光试剂： 1 1 荧光试剂的合成与精制【2 1 】： 量取O 2 6g R u C l 3 ，加入5 6 4 m l 含水1 0 的7 , - - 醇，在1 2 0 ( 2 下搅 拌使成混悬液；将O 9 4 5 8 9 ( 2 2 6 r e t 0 0 1 ) 4 , 7 双( 4 -
5、丙基苯) - 1 ，1 0 一二氮杂 菲( B P P P ) 溶于2 5m l 含水1 0 的乙二醇和2 5m l 六甲基磷酰三胺， 加热溶解后，加入液；混合液在1 9 0 的油浴温度下搅拌4 5 小时后， 冷却至5 5 ，转入1 0 0 m l 的小烧杯内，加入丙酮和1 高氯酸的混合液 ( 丙酮和高氯酸之比为3 2 5 m l ：5 0 m 1 ) ，有颗粒状的沉淀析出，将此溶 液在冰箱的冷藏室内( 4 ) 放置一晚；过滤反应液，沉淀分别用水和 己烷进行洗涤；将沉淀转移N d , 烧杯中，放在4 0 C 水浴中用丙酮溶解， 使之恰好饱和，加入约1 4 丙酮量的双蒸水，溶液中再次出现沉淀，将
6、 此溶液在冰箱的冷藏室内( 4 ) 放置1 2 小时；过滤反应液，沉淀分 别用水和己烷进行洗涤：取少量沉淀用丙酮溶解，与R u C l g 水、B P P P 丙酮、对照品R u B P P P ，丙酮进行T L C 比较，( 条件：硅胶G 板；展开 剂：二氯甲烷丙酮( 8 0 ：2 0 ) ) ，发现本次合成的产物中已无R u C l 3 ( 斑 点停留在原点，R f 值为O ) 、B P P P ( 斑点显蓝色荧光，且R f 值最大) 等原料残余物，但在R u B P P P 的主斑点( 显橘红色荧光) 下方有大量 的棕红色杂质干扰，将沉淀重结晶后，再次用T L C 法检验，发现棕红 色斑
7、点已大大减少，基本与R u B P P P 对照品的杂质水平相当，但原点 $ 一部分 处的斑点较对照品深，且沉淀粉末的颜色也偏深：反复多次重结晶， 并将水：丙酮的比值升至1 ：1 ；直到T L C 的结果反映原点处的杂质颜色 已与对照品相当，且沉淀的颜色转变为深红棕色：将沉淀置于4 0 。C 真 空中干燥完全后( 即连续两次称重差值小于O 3 m g ) ，得到O 5 3 2 4 9 ( O 3 6 3 m m o l ，收率1 9 4 ) 的深红棕色粉末： 1 2 荧光试剂的结构确证： 分别称取本实验室以前合成的对照品R u B P P P 和本次合成产物各 0 0 7 3 6 9 ，乙醇溶
8、解后，于5 0 m l 容量瓶中定容，即为1 X 1 0 3 m o l 1 的溶 液，分别进行紫外可见光光谱、红外光谱、荧光光谱对照。( 详见图 1 1 图1 _ 3 ) 3 0 0 0 o 0 0 0 m 图1 1 荧光试剂的紫外光谱对照 ：荧光试剂对照品：白合成荧光试剂 最大吸收波长分别为： 2 0 9 r i m 、2 8 2 n m 、4 6 6 n m 焉曲分新专土删截硕士研竟生论文 ? = 。5 一- E ；r T7 F ；。I J 。F 二t ；! I2 “。3 。：8 、品F 菇嚣_ 三舀F 葡面1 磊F 订五酝r 1 订， w R v E N u H 0 R 图1 2 荧光
9、试剂的红外光谱对照 ( 上：荧光试剂对照品；下：自合成荧光试剂) 图1 3 荧光试剂的激发光谱( 左) 对照和发射光谱( 右) 对照 ：荧光试剂对照品；：自合成荧光试剂 ( xe x ：3 7 0 n t o ，4 $ O n m e m ：5 9 0 h m ) 等，燃辩|耀。 ， ，ji 瓢、强 F * * ， 第一部分 由各图谱对照可知，本次合成的荧光试剂与对照品的各图谱的形 状和特征峰的位置相同，强度较一致，说明本次合成的荧光试剂结构 确为R u B P P P ( 结构如图1 4 ) ，且纯度相当。 ( C 1 0 4 ) 2 图1 4 荧光试剂R u B P P P 的化学结构图
10、2 制膜方法( 材料) 的初步选择； 分别按照以下各方法制备氧敏感膜，并考察膜片的性能，以选择 最佳的制膜方法。 2 1 敏感膜的制备 聚苯乙烯( P s ) 膜2 2 I ： 取聚苯乙烯O 6 9 ，加入氯仿6 m l ，超声振溶后加入磷酸三丁酯 0 1 5 m l ，再次混匀，待用；取制得的混合液1 0 m l ，加入R u B P P P l 2 8 m g 混匀；用注射器取0 3 m l 混合液，将圆形玻璃片置于旋转制膜机上，控 制制膜机的电压在1 0 0 伏特，当制膜机的转速达到匀速以后，将膜液 于玻片中心上方5 m m 处迅速注射于玻片表面；膜液立刻在玻片表面展 开，继续旋转1 5
11、 秒后停机，待膜液完全挥干后，即得R u B P P P 聚苯乙 烯膜。 溶胶凝胶膜o 矧： 取正硅酸乙酯4 4 m l 、两次蒸馏水1 4 m l 、盐酸( 0 1 m o l 1 ) 1 0 m l 菊物分析专生嬲设硕士竹宪生论文 超声混匀至无明显界面( 需3 小时以上) ，静置至澄清后待用；取制得 的储备液O 5 m l ，加入含有R u B P P P1 2 8 m g ，超声混匀，加入p H6 0 的 磷酸盐缓冲液O 5 m l ，再次超声混匀，即得含荧光试剂的溶胶凝胶混合 液：用移液器吸取5 雌l 含荧光试剂的混合液，滴在圆形玻璃片表面， 待液面完全铺满玻片表面后，立即水平置于含有
12、少量双蒸水的培养皿 中密闭老化，同时，为了防止膜片干裂，需每天喷洒少量水在膜片表 面，老化7 天后，检测膜片性能。 溶胶凝胶膜1 ： 取乙醇1 ，5 m l 、四乙氧基硅烷1 5 m l 、T r i t o nX 1 0 05 # 1 、O 0 3 m o l 1 盐 酸O 8 m ! ，在干燥洁净的小型针药瓶中初步混匀后，再放入超声清洗机 中超声3 0 分钟，即可得到均一澄清的液体，待用：取上述溶液l m l ， 加入R u B P P P1 2 8 m g ，再次超声混匀，闭塞静置一晚；用移液器吸取 5 0 9 】含荧光试剂的混合液，滴在圆形玻璃片表面，使之展开，并完全 铺满玻片表面，3
13、 0 分钟内膜液即发生固化，随后将玻片水平置于含有 少量双蒸水的培养皿中密闭老化，同溶胶凝胶法，为防干裂，每天 喷洒少量水在膜片表面，7 天后，检测其性能。 溶胶凝胶法： 取乙醇1 0 m l ，T E O S 和M T E O S ( 体积比1 ：2 ) 混合液1 0m l ，H C l ( O 0 3 m o l L ) O 5 4 m l ，超声将以上溶液混匀后，闭塞静置一晚，待用； 取上述溶液l m l ，加入R u B P P P1 2 8 r a g ，再次超声混匀，密闭，在暗处 静置一周后，待用；取含荧光试剂的储备液5 0 m ，平铺于直径2 5 r a m 的 洁净干燥的圆形光
14、学玻片上，一分钟后固化成膜。在室温下老化一周 后，测定膜片性能。 2 2 膜片的性能对比： 2 2 1 膜片的表观性状考察： 第一螂弓 观察荧光物质是否分散均匀，膜片的机械强度，以及膜片有无破 裂和脱落的现象，结果见表1 1 。 表1 1 各敏感膜片的性状对比 膜片类型膜片均匀度膜片的机械强度 不易从玻片上脱落，但溶于有 聚苯乙烯膜 膜片均匀，透明 机试剂 极差，可发现大量荧光试剂膜片干燥后，立刻出现破裂现 溶胶凝胶膜 聚集成不透明的黑点象，并大量从玻片上脱落 膜片中心与玻片结合较牢，但 溶胶凝胶膜膜片均匀，透明 膜片边缘有少量的脱落现象 膜片均匀，透明，但仍可见整个膜片与玻片结合十分牢 溶胶
15、凝胶膜 少量荧光试剂聚集成的黑点固，且不溶于有机试剂 由表1 1 可知，溶胶凝胶膜与溶胶凝胶膜表观性状较好。 2 2 2 膜片的光学性毹和氧敏感度考察： 将自制的各类型的荧光膜片置于流通池中，通过双臂光纤与 R F 5 0 0 0 荧光分光光度计整合后，在同一条件下，通入纯氮和纯氧，并 测定对各膜片的荧光强度和对气态氧的响应情况( 见表1 2 ) 。 膜片、流通池及荧光计的整合见图1 5 【2 ” 图1 5 流通池示意图 1 烈臂光纤柬：2 紧固件；3 圆形玻片( 面向流通池一侧为敏感膜) 4 O 型圈：5 微型流通池：6 溶液出口；7 溶液入口 荡畅分析专生删锻硕士舛竟生论文 双臂光纤束的一端与荧光计的单色器耦联，将激发光导入流通池 的玻片背面，而另一端与荧光计的检测器耦联，输出待检荧光。敏感 膜置于流通池内侧，能与进入微型流通池( O 型圈中空腔构成) 的溶液 或气体接触。测定时整个流通池完全避光。 实验条件：岛津R F 5 0 0 0 荧光分光光度计：激发波长4 8 0 n m 、 发射波长5 9 0 n m ，检测器端置0 5 6 滤光片，单色器端和检测器端狭缝 均设为1 5a m ，灵敏度设为高灵敏度； 测定结果：见表1 2 。 表1 2 各膜片的氧敏感度对比 膜片类型F N lF 0 2 Q ( ) 聚苯乙烯膜3 0 0 2 7 58 r 3 溶胶凝胶
